華蟾素注射液對人淋巴管內(nèi)皮細胞增殖及管狀結(jié)構(gòu)形成的影響

大連醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011

華蟾素注射液對人淋巴管內(nèi)皮細胞增殖及管狀結(jié)構(gòu)形成的影響

高山 陳秀英 付海燕 崔曉楠

大連醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011

背景與目的：華蟾素注射液是一種傳統(tǒng)抗腫瘤中藥制劑，目前藥效機制尚不明確。本研究旨在探討華蟾素注射液對人淋巴管內(nèi)皮細胞(human lymphatic endothelial cells，HLEC)增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。方法：通過繪制細胞生長曲線，觀察華蟾素注射液對HLEC增殖的影響；通過細胞遷移實驗觀察華蟾素注射液對HLEC遷移的影響；通過基質(zhì)膠實驗觀察華蟾素注射液對HLEC管狀結(jié)構(gòu)形成的影響；采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)觀察華蟾素注射液對HLEC中VEGFR-3及HGF蛋白表達的影響。結(jié)果：隨著華蟾素注射液藥物濃度增加(0.105、0.21和0.42 μg/mL)，HLEC抑制率逐漸增高，遷移率分別為0.87±0.07、0.69±0.05、0.37±0.02，對照組為1±0.03；HLEC成管率為0.90±0.06、0.83±0.02、0.63±0.05，對照組為1±0.02，VEGFR-3/β-actin光密度比值為0.440±0.017、0.618±0.100、0.803±0.091，對照組為1.030±0.017；HGF/ β-actin光密度比值為0.293±0.021、0.540±0.027、0.760±0.087，對照組為0.940±0.020 (P＜0.05)。結(jié)論：華蟾素注射液能夠顯著抑制HLEC增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成，并下調(diào)VEGFR-3和HGF蛋白的表達，對VFGFR-3信號轉(zhuǎn)導通路的影響可能是抑制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的機制之一。

華蟾素注射液；HLEC；增殖；遷移；管狀形成；VEGFR-3；HGF

［Key words］ Cinobufacini injection; HLEC; Proliferation; Migration; Tube-like structure formation; VEGFR-3; HGF

作為腫瘤早期轉(zhuǎn)移的主要方式，對淋巴道轉(zhuǎn)移的有效干預，是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移早期治療的基本策略［1］，然而目前尚無明確的淋巴道轉(zhuǎn)移抑制藥物。有研究表明，腫瘤誘導的淋巴管生成是腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移演進過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］，腫瘤淋巴管生成是腫瘤細胞與淋巴管內(nèi)皮細胞相互作用的結(jié)果，在這個互動過程中，腫瘤細胞表達諸多淋巴管生成因子，與腫瘤內(nèi)部或周圍的淋巴管內(nèi)皮細胞受體相互作用，激活了淋巴管內(nèi)皮細胞的信號轉(zhuǎn)導通路，進而誘導腫瘤淋巴管形成，其中VEGF-C/VEGF-D/ VFGFR-3信號轉(zhuǎn)導通路是迄今公認的淋巴管生成信號轉(zhuǎn)導通路［3-4］。華蟾素注射液是我國自主研制的抗腫瘤中藥制劑，能夠抑制多種腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移［5］，然而機制有待探討。本研究觀察華蟾素注射液對人淋巴管內(nèi)皮細胞(human lymphatic endothelial cells，HLEC)增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成的影響，初步探討可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

HLEC購自上海麗臣商貿(mào)有限公司。華蟾素注射液購于安徽金蟾生化股份有限公司(每支5 mL，含量以其主要成分吲哚生物堿為標量測定)?；|(zhì)膠購自GIBICO公司。臺盼藍購自邁晨科技有限公司。蘇木精、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根酶標記山羊抗小兔IgG(H +L)、β-actin單克隆抗體購自中杉金橋生物公司。Flt-4(M-20)：sc-637、HGFα(H-145)：sc-7949購自Santa Cruz Biotechnology公司。PVDF膜、蛋白酶抑制劑為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

將HLEC常規(guī)復蘇后接種于含10%新生牛血清的低糖IMDM培養(yǎng)液，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，行細胞計數(shù)。

1.3 細胞增殖實驗

取Transwell(0.4 μm孔徑，6孔培養(yǎng)板)小室。將HLEC消化制成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×104/mL，分別接種1 mL于下室內(nèi)，于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。12 h后，按照實驗分組要求(表1)，分別接種不同濃度華蟾素注射液于上室，并設(shè)立空白對照，放于溫箱中共培養(yǎng)。

表 1 實驗分組及給藥濃度Tab. 1 Experimental groups and dose of medication

實驗中各組分別設(shè)6個時間平行孔，每個時間點又分別設(shè)3個復孔。每隔24 h、連續(xù)6 d分別對下室的HLEC進行臺盼藍染色。每個樣本隨機選取5個視野(×200)計數(shù)，并記錄每個時間點的平均細胞數(shù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標、平均細胞數(shù)為縱坐標繪制細胞生長曲線。本實驗重復3次。

1.4 細胞遷移實驗

取Transwell (8 μm孔徑，24孔培養(yǎng)板)小室，其中上室內(nèi)加入預先鋪設(shè)基質(zhì)膠10 μL。下室加入600 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)液，于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。將HLEC消化制成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1× 105/mL，按照實驗分組要求(表2)，分別接種HLEC細胞和華蟾素注射液于上室，設(shè)立空白對照，然后放于溫箱中培養(yǎng)。

表 2 實驗分組及給藥濃度Tab. 2 Experimental groups and dose of medication

培養(yǎng)24 h后取出上室，擦去內(nèi)表面的基質(zhì)膠和HLEC。上室置入95%乙醇固定10 min，行HE染色。倒置相差顯微鏡下照相，計數(shù)遷移到insert外表面的細胞數(shù)量。每個樣本隨機計數(shù)5個視野(×200)的細胞數(shù)，取平均值進行比較。實驗重復3次。

1.5 基質(zhì)膠實驗

取Transwell (0.4 μm孔徑，6孔培養(yǎng)板)小室。其中，6孔培養(yǎng)板預先鋪設(shè)基質(zhì)膠每孔800 mL，基質(zhì)膠(10 g/L)與無血清的EBM-2(含10 μg/L VEGF-C)按4∶1加入。將HLEC消化制成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×104/mL，分別接種1 mL于下室內(nèi)，于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃溫箱中培養(yǎng)。按照實驗分組要求(表1)，接種華蟾素注射液于上室，設(shè)立空白對照，放于溫箱中共培養(yǎng)。

24 h后，倒置相差顯微鏡亮視野觀察淋巴管內(nèi)皮細胞聚集和管狀結(jié)構(gòu)形成情況。鏡下(×200)隨機選取5個視野，計數(shù)淋巴細胞聚集數(shù)量和管狀結(jié)構(gòu)形成情況。實驗重復3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測VEGFR-3及HGF的表達

處于對數(shù)生長期的HLEC消化傳代，均勻接種于4個25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，設(shè)立對照組和實驗組(華蟾素注射液濃度分別為0.42、0.21和0.105 μg/mL)，培養(yǎng)24 h后，收集細胞，常規(guī)方法提取總蛋白，蛋白樣品采用Bradford法測定總蛋白含量。SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為8%，每孔上樣50 μg，電泳完畢后經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h。按適當比例加入一抗 4 ℃搖床過夜，PBST洗膜3次，用辣根酶標記的抗體(1∶3 000)PBST溶液37 ℃溫育1 h，PBST溶液洗膜3次。最后進行ECL試劑反應(yīng)顯色，X線膠片曝光1～5 min后顯影，膠片晾干、掃描、照相，并用Image-J軟件的圖像分析儀分析。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 華蟾素注射液對HLEC增殖的影響

通過繪制細胞生長曲線，觀察華蟾素注射液對HLEC增殖的影響。藥物組(A、B、C組) HLEC增殖速度明顯慢于空白對照組(D組)，且隨著藥物濃度增大，HLEC細胞增殖速度減慢。此結(jié)果表明，華蟾素注射液對HLEC細胞增殖有明顯抑制作用，并隨著藥物濃度增大，作用時間延長，抑制作用增強，表現(xiàn)為濃度依賴性及時間依賴性(P＜0.05，圖1、2) 。

2.2 華蟾素注射液對HLEC遷移的影響

通過細胞遷移實驗，觀察華蟾素注射液對HLEC遷移的影響。在0.105、0.21和0.42 μg/mL華蟾素注射液作用下，HLEC遷移率分別為0.87±0.07、0.69±0.05、0.37±0.02，顯著低于對照組(1±0.03，P＜0.05)。表明華蟾素注射液能顯著抑制HLEC遷移，隨著藥物濃度增大，抑制作用增強，呈劑量依賴性(圖3、4)。

圖 1 華蟾素注射液對 HLEC增殖的影響Fig. 1 Cinobufacini injection caused a morphology change of HLEC (×200)

圖 2 華蟾素注射液對HLEC增殖的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effect of Cinobufacini injection on proliferation of HLEC

2.3 華蟾素注射液對HLEC管狀結(jié)構(gòu)形成的影響

通過基質(zhì)膠實驗，觀察華蟾素注射液對HLEC管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。在0.105、0.21和0.42 μg/mL華蟾素注射液作用下，HLEC成管率分別為0.90±0.06、0.83±0.02、0.63±0.05，顯著低于對照組(1±0.02)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明華蟾素注射液能顯著抑制HLEC細胞成管，隨著藥物濃度增大，抑制作用增強，呈劑量依賴性(圖5、6)。

圖 3 HLEC遷移圖片(光鏡 ×200)Fig. 3 The picture of HLEC migration (light microscope×200)

圖 4 華蟾素注射液對HLEC遷移的影響Fig. 4 Inhibitory effect of Cinobufacini injection on migration of HLEC

2.4 華蟾素注射液對HLEC VEGFR-3與HGF蛋白表達的影響

隨著給藥組華蟾素注射液濃度的增高，HLEC表達VEGFR-3和HGF降低。0.42、0.21和0.105 μg/mL濃度的華蟾素注射液作用 HLEC 24 h后，VEGFR-3蛋白與β-actin蛋白條帶的光密度比值為0.440±0.017、0.618±0.100、0.803±0.091，顯著低于對照組1.030±0.017(P＜0.05)；HGF蛋白與β-actin蛋白條帶的光密度比值(0.293±0.021、0.540±0.027、0.760±0.087，顯著低于對照組0.940±0.020(P＜0.05)，提示華蟾素注射液可抑制VEGFR-3和HGF蛋白表達，呈劑量依賴性(圖7、8)。

圖 5 HLEC成管圖片F(xiàn)ig. 5 The picture of HLEC into a tube

圖 6 華蟾素注射液對HLEC成管的影響Fig. 6 Inhibitory effect of Cinobufacini injection on tube-like structure formation of HLEC

3 討 論

伴隨著對淋巴管內(nèi)皮標志物LYVE-1、podoplanin、VEGFR-3的研究［6-8］，腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)研究取得了進展。有研究表明，腫瘤誘導的淋巴管生成是腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移演進過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］，腫瘤細胞與淋巴管內(nèi)皮細胞互動的過程中，腫瘤細胞表達諸多淋巴管生長因子，與淋巴管內(nèi)皮細胞受體相互作用，激活了淋巴管內(nèi)皮細胞的信號轉(zhuǎn)導通路，其中VEGF-C/VEGFR-3是目前公認的淋巴管內(nèi)皮細胞信號傳導通路，誘導了淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、出芽、管道形成、遷移、侵襲等腫瘤淋巴管形成過程［1-2］。干預腫瘤淋巴管生成或VEGF-C/VEGFR-3信號轉(zhuǎn)導通路已成為抑制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的基本策略。

圖 7 Western blot檢測VEGFR-3表達Fig. 7 The expressions of VEGFR-3 tested by Western-Blot

圖 8 Western blot檢測HGF表達Fig. 8 The expressions of HGF tested by Western blot

華蟾素注射液有效成分總稱為蟾蜍毒素類(bufotoxins), 包括蟾蜍甾二烯類、強心甾烯蟾毒類、吲哚堿類、醇類及多糖、氨基酸、肽類、腎上腺素等［10］。臨床評價表明，華蟾素注射液能夠抑制多種腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為高效低毒的抗癌作用［11］。有研究報道，華蟾素注射液能夠誘導腫瘤細胞凋亡，阻斷細胞周期，調(diào)節(jié)宿主骨髓功能及提升免疫力［12］，表現(xiàn)多靶位的抗腫瘤功能。

本研究結(jié)果顯示，華蟾素注射液能顯著抑制HLEC的增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成，顯示了直接淋巴細胞抑制和腫瘤淋巴管形成抑制作用，VEGFR-3為表達淋巴管內(nèi)皮細胞的淋巴管生成因子VEGF-C/VEGF-D受體，表達于腫瘤細胞的VEGF-C/VEGF-D與表達于淋巴管內(nèi)皮細胞的VEGFR-3結(jié)合后，激活了淋巴管內(nèi)皮細胞的信號轉(zhuǎn)導通路，進而誘導了腫瘤淋巴管形成。HGF為來源于間質(zhì)細胞的肝細胞生長因子，具有趨化性和化學激活性，能使包括多種惡性腫瘤細胞在內(nèi)的許多細胞能動性增高，細胞群離散，促進了細胞的遷移［13］。本研究揭示華蟾素注射液下調(diào)VEGFR-3、HGF蛋白表達，可能是其調(diào)控HLEC生物學行為機制之一。因此，華蟾素注射液是一種有前景的腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移抑制藥物。

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The effect of cinobufacini injection on proliferation and tube-like structure formation of human lymphatic endothelial cells

GAO Shan, CHEN Xiu-ying, FU Hai-yan, CUI Xiao-nan (Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116011, China)

CUI Xiao-nan E-mail: cxn23@sina.com

Background and purpose:The cinobufacini injection is a traditional antitumor drug. However, its mechanism is still unclear. The purpose of this study was to observe the effect of cinobufacini injection on proliferation, migration and tube-like structure formation of human lymphatic endothelial cells (HLEC). Methods: Cell growth curve was used to observe the effect of cinobufacini injection on the proliferation of HLEC; Migration assay was used to observe the effect of cinobufacini injection on the migration of HLEC; Matrigel assay was used to observe the effect of cinobufacini injection on the tube-like structure formation of HLEC; Western blot was used to analyze the expression of VEGFR-3 and HGF in HLEC under the action of cinobufacini injection. Results:With the increase of cinobufacini injection concentration (0.105, 0.21 and 0.42 μg/mL), HLEC inhibition rate gradually increased; Migration rates were 0.87±0.07, 0.69±0.05, and 0.37±0.02; and 1±0.03 in control group. HLEC into the tube rates were 0.90±0.06, 0.83±0.02, and 0.63±0.05; and 1±0.02 in control group. VEGFR-3/β-actin optical density ratios were 0.440±0.017, 0.618±0.100, and 0.803±0.091; and 1.030±0.017 in the control group. HGF/β-actin ratios of the optical density were 0.293±0.021, 0.540±0.027, and 0.760±0.087; and 0.940±0.020 in control group (P＜0.05). Which showed that cinobufacini injection significantly inhibited HLEC proliferation (P＜0.05), migration (P＜0.05) and tubelike structure formation in dose dependent ways(P＜0.05). Cinobufacini injection significantly descreased the expression of VEGFR-3 and HGF in HLEC in dose dependent ways(P＜0.05). Conclusion:Cinobufacini injection significantly inhibits HLEC proliferation, migration and tube-like structure formation, and the down-regulation of VEGFR-3 and HGF may contribute to the inhibition of cinobufacini injection on HLEC.

R73-36+1

：A

：1007-3639(2013)01-0036-06

2012-08-16

2012-11-19）

崔曉楠 E-mail:cxn23@sina.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.01.006