EM L4-ALK融合基因在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義

韓衛(wèi) 綜述 畢明宏 審校

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是發(fā)病率及癌癥相關(guān)致死率最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%-85%。由于早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時多為中晚期，傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、放療、化療能改善近期療效，但對生存期的延長作用有限。分子靶向治療是近年來惡性腫瘤治療領(lǐng)域的“王牌”，其特點是能選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞，定向阻斷癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖、信號傳導(dǎo)，阻止腫瘤新生血管的生成，破壞癌細(xì)胞的新陳代謝[2]，故其特異性高，不良反應(yīng)小，是目前最具前景的研究領(lǐng)域。棘皮動物微管相關(guān)類蛋白4與間變性淋巴瘤激酶融合基因（chinodem microtubule-associated protein-like 4/anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）有望成為繼表皮生長因子受體（epidermal grow th factor receptor, EGFR）后另一種有明確療效預(yù)測作用的分子標(biāo)志物，它被證實是NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中獨立而又關(guān)鍵的分子靶點，在NSCLC中的發(fā)生率約為5%。本文主要介紹EML4-ALK融合基因的結(jié)構(gòu)特點、臨床病理特征，常用于篩檢EML4-ALK融合基因的方法，簡述ALK抑制劑臨床研究進(jìn)展，并評價其在NSCLC治療中的地位和意義。

1 EML4-ALK融合基因概述

ALK基因最初是在間變性T細(xì)胞淋巴瘤和炎性成纖維細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)其參與形成的融合基因（X-ALK）與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3]。2007年Soda等[4]首次發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因存在于部分NSCLC中。研究者在1例男性吸煙的肺腺癌患者標(biāo)本中擴(kuò)增出由EML4和ALK融合而成的DNA片段，它編碼的蛋白質(zhì)包含了1,059個氨基酸。蛋白質(zhì)的N端 （殘基1-496）為人EML4基因的一部分，而C端殘基（497-1,059）則是人ALK基因的胞內(nèi)域。

EML4隸屬于棘皮動物微管相關(guān)類蛋白家族，包括WD-重復(fù)區(qū)、N端Basic區(qū)和HELP域。它們都和EML4-ALK腫瘤生成的潛能有關(guān)，且Basic區(qū)在EML4-ALK二聚體化的過程中扮演著重要的角色，去除Basic區(qū)可使EML4-ALK融合蛋白的催化活性降低84%，可以推斷Basic區(qū)可能是EML4-ALK融合蛋白發(fā)揮作用的關(guān)鍵區(qū)域。

ALK則是胰島素受體超家族的成員，可與ATIC-、TFG-、CLTC-等多種基因發(fā)生融合，其結(jié)構(gòu)包括：胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)。

EML4與ALK定位于2號染色體短臂上，但兩者方向相反，相隔12 Mb，融合時須EML4或ALK其中之一反向與對方連接，EML4-ALK基因亞型取決于兩者斷裂相接的位置，因此EML4斷裂點呈現(xiàn)出多變性，目前已檢測到的斷裂點有2、6、13、14、15、17、18、20號外顯子，這些形成了至少11種EML4-ALK融合基因亞型，已有實驗[4-11]證實它們中的大部分能促進(jìn)腫瘤生成 。

2 EML4-ALK融合基因的檢測方法

檢測EML4-ALK融合基因的方法很多，主要包括免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光原位雜交技術(shù)和RACE-偶聯(lián)PCR測序等，現(xiàn)將常用的檢測方法簡述如下：

2.1 免疫組織化學(xué)（immunohistochem istry, IHC） IHC是病理檢測的主要方法之一。因其操作簡便、成本低、工作量較小而被廣泛應(yīng)用于臨床和科研工作中，IHC的最大優(yōu)勢是能檢測到腫瘤特異性抗原，但不會破壞細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)特征。實驗證實IHC同F(xiàn)ISH和RT-PCR檢測EML4-ALK融合基因的結(jié)果具有一致性，但其敏感性劣于FISH和RT-PCR法，而且不能鑒定ALK融合患者具體來自哪種變體亞型。因此，可以將IHC法作為篩查EML4-ALK融合基因的方法。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR） RT-PCR法是一種敏感性高的基因檢測方法，可以檢測到很低拷貝數(shù)的RNA，可能是確認(rèn)NSCLC存在ALK融合基因的一種快速診斷方法。利用術(shù)后或其它方法取得的標(biāo)本，獲得總RNA后進(jìn)行RT-PCR，對PCR產(chǎn)物進(jìn)一步分析以確定是否含有EML4-ALK融合基因，該法需要高質(zhì)量的RNA，但石蠟切片中的DNA及RNA在檢測過程中會逐漸降解，最終會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，RT-PCR更適用于新鮮組織標(biāo)本的基因檢測。但其缺點在于對引物要求很高；分辨不出EML4-ALK融合基因的未知亞型；假陽性率較高。由于此方法操作復(fù)雜，在常規(guī)臨床診斷實驗室可能難于施行。

2.3 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）FISH法應(yīng)用探針特異性標(biāo)記細(xì)胞核中ALK斷裂點來檢測ALK重排，分離的熒光信號提示存在ALK重排。相比IHC和RT-PCR，F(xiàn)ISH法的敏感性和特異性都很高，但并不是萬無一失。與PCR不同，F(xiàn)ISH不能鑒別出不同的EML4-ALK融合基因變異體，且其價格昂貴，分離的熒光信號不易解釋。目前，ALK靶向藥物克里唑替尼（Crizotinib,PF-02341066）臨床前試驗中將FISH法作為EML4-ALK融合基因的檢測方法。

2.4 RACE-偶聯(lián)PCR測序（RACE-coupled PCR sequencing）張緒超等[12]使用該法檢測分析ALK基因的融合變異，他們采用cDNA末端快速擴(kuò)增（PACE）技術(shù)結(jié)合兩輪PCP技術(shù)來擴(kuò)增ALK基因的融合變體，敏感性高，其優(yōu)點是能檢測到EML4與ALK或其它任何基因的融合，測序后還能發(fā)現(xiàn)是來自哪一種EML4-ALK變體的融合。但目前只有張緒超等[12]的研究應(yīng)用了這種檢測技術(shù)，還需要更多的研究加以驗證。

越來越多的標(biāo)本進(jìn)行了EML4-ALK融合基因的檢測，其中以RT-PCR法的應(yīng)用最為廣泛，但目前仍無敏感特異的方法用于EML4-ALK融合基因的檢測。未來的發(fā)展方向在于尋找有效可行的方法用于準(zhǔn)確檢測ALK基因融合。

3 EML4-ALK融合基因與NSCLC的臨床病理關(guān)系

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）治療有效的患者被證實有其獨特的臨床病理學(xué)特征，如：亞裔、不吸煙、女性、腺癌。決定EGFR-TKI療效的關(guān)鍵在于EGFR的19、21外顯子突變。NSCLC中EML4-ALK融合基因陽性的患者是否也有其獨特的臨床病理特征，世界各地的科學(xué)家們對此進(jìn)行了深入的研究。

日本的Inamura等[13]用RT-PCR法檢測了363例肺癌患者的病理標(biāo)本，11例（3%）標(biāo)本中檢出EML4-ALK融合基因，患者病理分型均為腺癌，進(jìn)一步研究證實EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC具有以下的特征：腺泡組織來源，分化更差；常有TTF-1表達(dá)，偶有TP53突變，極少有EGFR及K-ras的突變；更常見于輕度或不吸煙的患者。

香港的Wong等[8]檢測了266例原發(fā)性肺癌患者的術(shù)后病理標(biāo)本，對EML4-ALK、KRAS、EGFR 3種基因的陽性率進(jìn)行比較和統(tǒng)計學(xué)分析處理，共檢出野生型EGFR、KRAS陽性119例，其中13例（4.9%）EML4-ALK基因表達(dá)陽性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這13例包括11例腺癌和2例腺鱗癌，他們也發(fā)現(xiàn)了EML4-ALK融合基因更常見于不吸煙、年輕和EGFR、K-ras野生型的肺癌患者中，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

根據(jù)以上試驗結(jié)果，2009年Shaw等[14]進(jìn)行了更有針對性的研究，共選擇了141例NSCLC患者，入組條件為女性、亞裔、不吸煙或輕度吸煙和腺癌中至少有2項符合，用FISH方法檢測了標(biāo)本中的情況，共檢出了19例（13%）EML4-ALK融合基因，包括18例腺癌和1例腺鱗癌，發(fā)生EML4-ALK、EGFR及K-ras突變的患者沒有重疊。

2009年張緒超等[15]用RACE-PCR在109例NSCLC的標(biāo)本中檢出12例EML4-ALK陽性（11.01%）。所有EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者均不與K-ras突變共存，但意外的在1例女性肺腺癌患者中發(fā)現(xiàn)了EML4-ALK融合基因與EGFR 19號外顯子突變的共存。

多項臨床研究已經(jīng)證實：EM L4-ALK融合基因是NSCLC患者又一常見的臨床亞組，其典型的臨床特征包括：男性、既往不吸煙或輕度吸煙史、年輕患者、腺癌或以腺癌細(xì)胞為主的病理類型、EML4-ALK融合基因與EGFR突變和K-ras突變不共存。這對臨床上可以更加快速有效地篩選目標(biāo)人群有著極大的意義。

4 ALK抑制劑

EML4-ALK作為一個潛在的NSCLC的治療靶點，目前已進(jìn)入臨床實驗研究階段的ALK抑制劑只有克里唑替尼（PF-02341066），它同時也是MET/HGF受體酪氨酸激酶抑制劑，由輝瑞公司研制。它是一種選擇性的ATP竟?fàn)幮孕》肿右种苿?，抑制c-Met/肝細(xì)胞生長因子受體（hepatocyte grow th factor receptor, HGFR）和ALK酪氨酸激酶及他們的致癌變異體（如c-Met/HGFR突變變異體或ALK融合蛋白）。體內(nèi)外試驗均證實，此藥可以劑量依賴性抑制腫瘤細(xì)胞c-Met/HGFR、ALK和某些變異體的磷酸化及激酶靶位依賴功能。推薦劑量為250 mg（po,Bid）。

I期臨床試驗結(jié)果[16]顯示，在82例可評價療效的患者中客觀緩解率為57%，8周疾病控制率達(dá)90%。平均治療時間是6.4個月，其中1例完全緩解，46例部分緩解，27例疾病穩(wěn)定。6個月無進(jìn)展生存率為72%，中位無進(jìn)展生存期9.2個月。所有患者M(jìn)ET為陰性（克里唑替尼的另外一個靶點），表明治療作用是通過抑制ALK完成。輕微的胃腸道反應(yīng)為主要不良反應(yīng)，如惡心（54%）、腹瀉（48%）和嘔吐（44%），但患者完全可以耐受，3/4度毒性只見于谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶的升高。

II期臨床試驗[17]證實，在50例可評價療效的患者中，客觀緩解率為64%，8周疾病控制率達(dá)到了90%，6個月無進(jìn)展生存率為72%，且中位治療時間均已多于25.5周，生存終點尚在觀察之中。胃腸道反應(yīng)仍是克里唑替尼的主要副反應(yīng)，但患者均可耐受。

克里唑替尼的I期/II期臨床試驗結(jié)果均證實了該藥抗癌效果滿意，安全性好。因此，2011年8月26日美國食品藥品管理局批準(zhǔn)克里唑替尼（PF-02341066）直接進(jìn)入III期臨床試驗（Profile-1007），中國也參與其中，Profile-1007是克里唑替尼的首個III期臨床試驗，在2012年歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會（European Society for Medical Oncology, ESMO）上，Shaw等[18]報告了該試驗的中期結(jié)果，該試驗共入組了347例既往接受過含鉑一線化療方案的IIIb期/IV期NSCLC患者，所有患者均經(jīng)FISH證實ALK陽性，實驗組的173例患者給予克里唑替尼（250 mg bid, q 21d），對照組的174例患者分別給予多西他賽（75 mg/m2, q 21d）或培美曲塞（500 mg/m2, q 21d）。隨機接受單藥化療的患者在疾病進(jìn)展后可接受克里唑替尼治療，因此，化療組的大多數(shù)患者最終接受了克里唑替尼治療。兩組總有效率分別為65.3%和19.5%（OR=3.4, 95%CI:2.5-4.7, P＜0.001），兩組無進(jìn)展生存期為7.7個月和3.0個月（HR=0.49, 95%CI: 0.37-0.64, P＜0.000,1）。以上試驗結(jié)果證實，克里唑替尼相對于單藥化療組明顯延長了無進(jìn)展生存期，提高了客觀緩解率。因此，對于ALK突變陽性的NSCLC患者來說，克里唑替尼可以作為晚期肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。Profile-1007比較克里唑替尼與二線化療方案的療效，而另一個III期臨床試驗Profile-1014則比較的是克里唑替尼與一線化療方案。該實驗入組標(biāo)準(zhǔn)是既往沒有接受過治療的ALK陽性局部晚期/轉(zhuǎn)移的非鱗狀NSCLC患者，入組的334例患者被隨機分配到克里唑替尼組和培美曲塞/順鉑或培美曲塞/卡鉑組，主要觀察終點是無進(jìn)展生存期。另外一個單臂的II期臨床研究（Profile-1005）[16]入組了250例由于接受過多的治療而不能入組III期臨床研究或者III期臨床研究中接受化療后卻進(jìn)展的NSCLC患者，服用克里唑替尼觀察其療效。

在治療初期克里唑替尼能取得非常好的療效，但與EGFR-TKIs及其它TKI一樣，最終腫瘤也會對克里唑替尼產(chǎn)生耐藥。Choi等[19]報道了1例應(yīng)用克里唑替尼治療有效5個月后卻發(fā)生繼發(fā)耐藥的病例。患者為28歲無吸煙史的男性肺腺癌，檢測未發(fā)現(xiàn)EGFR突變，經(jīng)過6周期的常規(guī)化療后腫瘤出現(xiàn)了進(jìn)展，檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤表達(dá)EML4-ALK融合基因的亞型1。經(jīng)過1周的克里唑替尼治療后，患者的癥狀較前明顯好轉(zhuǎn)。但5個月后腫瘤出現(xiàn)了進(jìn)展，導(dǎo)致雙肺腫瘤和胸腔積液的迅速增長。在該患者的胸水樣本中發(fā)現(xiàn)EML4-ALK激酶域有兩個突變（野生型ALK的cDNA核甘酸4 374和4 493，分別發(fā)生G→A和C→A的改變，頻率分別為41.8%和14.0%），這兩處堿基的改變導(dǎo)致該位點氨基酸改變，分別是C1156Y和L1196M，作者進(jìn)一步通過細(xì)胞株試驗及磷酸化檢測驗證了這兩個點突變的確可以導(dǎo)致對克里唑替尼的耐藥。針對L1196M耐藥后的治療，Katayama等[20]用比克里唑替尼活性更強的ALK抑制劑如TAE684和AP26113或是HSP90抑制劑進(jìn)行治療。Sakamoto等[21]也證實了ALK抑制劑CH 5424802能高選擇性的抑制L1196M突變的細(xì)胞生長。

5 小結(jié)及展望

目前認(rèn)為，EML4-ALK融合基因是NSCLC新一類的亞型。EML4-ALK融合基因的形成是由2號染色體短臂插入引起的，它至少有11種亞型。NSCLC中EML4-ALK融合基因陽性更常見年輕男性患者、輕度吸煙∕不吸煙、腺癌、K-ras或EGFR野生型。常用來檢測EML4-ALK的方法有IHC、RT-PCR、FISH和RACE-偶聯(lián)PCR測序，各方法有其優(yōu)缺點，有一定的互補性。ALK抑制劑克里唑替尼治療EML4-ALK陽性的NSCLC能取得較佳的療效，有望成為晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。

目前，基因檢測已經(jīng)從實驗室走進(jìn)了臨床工作中，眾多生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，為實現(xiàn)真正意義上的NSCLC“個體化”治療提供了契機。建議在選擇使用靶向治療前，制定合理的生物標(biāo)志物篩選方案，這有助于改善療效，提高治療成功率，避免某些過度治療，節(jié)約醫(yī)療成本。以生物標(biāo)志物為指導(dǎo)的個體化綜合治療模式將進(jìn)一步提高NSCLC患者靶向治療的療效和患者的生存質(zhì)量。

盡管克里唑替尼用于NSCLC患者的I期、II期臨床試驗結(jié)果令人鼓舞，但仍有許多問題有待進(jìn)一步研究，如檢測EML4-ALK融合基因的金標(biāo)準(zhǔn)是什么；EGFR突變與EML4-ALK融合基因的相互關(guān)系是什么；EML4-ALK融合基因的不同變體是否代表不同的臨床意義；EML4-ALK融合基因的在NSCLC中的陽性率是否存在地理或種族差異；EML4-ALK融合基因是否確實是克里唑替尼治療有效的療效預(yù)測分子；與現(xiàn)有的治療手段相比，克里唑替尼是否能取得明顯的客觀療效和生存期優(yōu)勢；對共存型NSCLC患者而言，多靶點抑制劑會不會是更好的選擇；耐藥機制仍不清楚以及耐藥后患者又該如何進(jìn)行治療等。期待更加深入的實驗和臨床研究來解決上述問題，從而使NSCLC的個性化治療得以在基因水平上實現(xiàn)。