病毒誘導(dǎo)的基因沉默在植物抗病基因功能研究中的應(yīng)用

張曉蘿，趙君

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

綜述

病毒誘導(dǎo)的基因沉默在植物抗病基因功能研究中的應(yīng)用

張曉蘿，趙君*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）是一種植物抵抗病毒侵入的自然機制，現(xiàn)在已被開發(fā)成通過插入目的基因片段的重組病毒來抑制植物內(nèi)源基因表達的遺傳技術(shù)，主要用于研究目標(biāo)基因的功能。作為一種新型的基因鑒定和功能研究的技術(shù)工具，VIGS具有無需事先知道目的基因全長序列、快速獲取表型、無需獲得轉(zhuǎn)基因植株等諸多優(yōu)點，已越來越廣泛地被應(yīng)用于植物基因功能研究領(lǐng)域。本文從VIGS的作用機制、VIGS體系的優(yōu)點及局限性以及VIGS在植物抗病機制方面的研究進展等幾個方面對病毒誘導(dǎo)的基因沉默進行了綜述。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）；抗病機制；基因功能

1 基因沉默現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

基因沉默現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)在1990年，Napoli等[1]在矮牽牛中超量表達與粉紅色色素合成有關(guān)的查耳酮合成酶基因（Chalcone synthase,CHS），結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多原來開紫花的牽?；ǖ念伾坏珱]有加深，反而變淺甚至白化，他們稱這種現(xiàn)象為共抑制（Cosuppressing），并推斷共抑制可能是由RNA介導(dǎo)的。1995年，Kumagai等[2]將人工構(gòu)建的植物內(nèi)源基因（PDS）的片段插入煙草花葉病毒基因組中使其產(chǎn)生包含正向或反向PDS序列片段的RNA時產(chǎn)生了光褪色現(xiàn)象，揭示內(nèi)源的PDS基因被沉默。1998年，F(xiàn)ire等[3]第一次證明了RNA沉默（RNA silencing）是由雙鏈RNA引起的，并第一次提出RNA干擾的概念（RNA－interference，RNAi）。RNA介導(dǎo)的基因沉默（RNA-mediated gene silencing）發(fā)生在RNA水平，是一種廣泛存在于各種生物中保守的基于核酸序列的特異性降解機制，不同領(lǐng)域的研究者給它作了不同的命名：在動物和線蟲中稱為RNA干擾（RNA－interference，RNAi)，在真菌中稱為基因消除（Gene quelling），而在植物中稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Posttranscriptional gene silencing,PTGS）[4]。自然界中，有些植物在受到某種病毒侵染后會出現(xiàn)癥狀的“恢復(fù)”現(xiàn)象，比如，在線蟲傳播的多面體病毒屬病毒（Nepovirus）侵染煙草屬寄主植株后，接種葉和下部非接種葉表現(xiàn)嚴(yán)重的病毒病癥狀，但病毒系統(tǒng)侵染后新形成的上部葉片則不表現(xiàn)癥狀，只積累少量的病毒[5]，即這些葉片已從發(fā)病狀態(tài)中“恢復(fù)”到正常生長狀態(tài)。后來在轉(zhuǎn)基因植株中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,即在接種病毒的初期，病毒正常增殖，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出病毒病的典型癥狀；但當(dāng)病毒進行系統(tǒng)擴散后，植株上部新生葉片中轉(zhuǎn)基因的表達水平降低，并且檢測不到病毒粒子，但卻對隨后新接種的同種病毒表現(xiàn)出一定的抗性水平[6]，后來研究者發(fā)現(xiàn)這些現(xiàn)象都是由于基因沉默導(dǎo)致的。

基因沉默（Gene silencing）是指在mRNA的表達水平抑制生物體內(nèi)的特定基因的表達，從而導(dǎo)致這些特定基因的沉默。在轉(zhuǎn)基因的研究中，常常出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默，又被稱為轉(zhuǎn)基因失活的現(xiàn)象?；虺聊F(xiàn)象大都與帶有同源序列的編碼區(qū)或啟動子的多拷貝有關(guān)，稱為同源依賴性的基因沉默（Homologydependentgene silencing）。轉(zhuǎn)基因沉默往往發(fā)生在轉(zhuǎn)基因與同源的內(nèi)源基因之間。轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因之間經(jīng)重組分離或減數(shù)分裂分離后，沉默的轉(zhuǎn)基因的表型才能夠得以恢復(fù)[7]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）是指攜帶植物功能基因cDNA的病毒在侵染植物體后，可誘導(dǎo)植物發(fā)生基因沉默而出現(xiàn)一定的表型變異。VIGS屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默即PTGS，這是細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA進入細胞質(zhì)后，由于轉(zhuǎn)入的基因編碼區(qū)與宿主細胞基因序列間存在著同源性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)入基因與內(nèi)源基因的表達同時受到抑制，這種共抑制是PTGS的主要機制。具有與病毒攜帶的基因同源序列的轉(zhuǎn)基因植物，在受到病毒侵染后，可在轉(zhuǎn)錄后水平將此病毒的mRNA降解掉，從而使得植株對病毒的侵染呈現(xiàn)出一定的抗性水平[8]。目前認(rèn)為，植物基因沉默是植物長期進化形成的用來防止外來遺傳物質(zhì)干擾自身基因組功能并保持自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的重要機制，是生物體中一種不完全的原始的生物免疫系統(tǒng)。植物中，常常利用報告基因即葡聚糖酶GUS（Glucanase）基因和綠色熒光蛋白GFP（Green fluorescent protein）基因來研究轉(zhuǎn)錄后基因沉默的傳導(dǎo)性[9]。

VIGS系統(tǒng)首先在本氏煙和番茄等茄科植物,擬南芥（十字花科）和大麥（禾本科）等植物中得到了驗證。如Kumagai等[2]利用煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）構(gòu)建了沉默載體。重組后的TMV病毒轉(zhuǎn)錄區(qū)含有一個體外合成的八氫番茄紅素合成酶基因（Phytoene synthase,PSY）序列片段，在注射到本氏煙草葉片后成功的沉默了本氏煙草PSY基因。隨后，研究者又發(fā)現(xiàn)馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）也可以作為基因沉默的載體，如1998年，Ruiz等[10]在PVX基因組上插入了一段PDS cDNA，重組病毒侵染植物后出現(xiàn)了光漂白現(xiàn)象，因此他們認(rèn)為PVX介導(dǎo)的VIGS可以有效地抑制植物內(nèi)源基因的表達。2004年，研究者們又發(fā)現(xiàn)了可以應(yīng)用于木薯（大戟科）和豌豆（豆科）等全新的VIGS載體，即TRV載體[11]。隨后，TRV載體系統(tǒng)的應(yīng)用范圍不斷被拓寬，并成功地應(yīng)用于茄科作物馬鈴薯中[12]。隨后，采用農(nóng)桿菌灌根法，研究者又將該載體系統(tǒng)拓寬到辣椒、煙草等茄科植物上[13-18]。2006年，TRV系統(tǒng)成功的被開發(fā)并應(yīng)用于玉米、大豆等重要的經(jīng)濟作物中[19]。最近，又有了基于PEBV（Pea earlybrowning virus,PEBV）和大麥條花葉病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV）為VIGS載體來沉默目的基因的報道。此外，也有VIGS成功地應(yīng)用于罌粟科的花菱草以及毛茛科耬斗菜中的相關(guān)報道[20]。因此，VIGS技術(shù)體系的建立，為研究目的基因在不同作物中的功能提供了一個高效的技術(shù)平臺。

2 病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的作用機制

2000年，Baulcombe[21]推斷VIGS機制中存在一種類似PTGS過程中的基因沉默信號，這種信號可能是dsRNA（Double-stranded RNA）。dsRNA是病毒復(fù)制過程中的中間體，也是誘導(dǎo)基因沉默的關(guān)鍵起始因子，它可以通過病毒的復(fù)制、RNA自我復(fù)制等機制而產(chǎn)生[22]。VIGS啟動時一般先形成雙鏈RNA，即dsRNA；當(dāng)dsRNA積累到一定程度后會被類似動物Dicer，也稱為Dicer-like（DCL）的RNase-III酶切割形成大小約為21～24 nt的小干擾siRNA（Short interfering RNA）。siRNA作為VIGS機制啟動的促發(fā)因子以單鏈形式與Argonaute（AGO）蛋白、RNA結(jié)合蛋白以及其他RNase結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex,RISC）。RISC是一種蛋白-RNA效應(yīng)核酸酶，由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等組成，對靶mRNA具有識別和切割作用，具有外源和內(nèi)源核酸酶活性，能夠特異地與同源的靶標(biāo)mRNA結(jié)合，并最終導(dǎo)致這些靶標(biāo)mRNA降解[23]。還有另外一種可能的情況是帶有siRNA的RISC特異地識別與siRNA高度同源的mRNA序列，并以mRNA為模版，以siRNA為引物在RNA聚合酶的作用下合成dsRNA，此雙鏈RNA在下一個循環(huán)中被降解掉[24]。為了抵抗植物中存在的VIGS系統(tǒng)對病毒侵入的抑制，許多植物病毒會產(chǎn)生VIGS抑制因子（Suppressor）。這些抑制因子通過與siRNA結(jié)合使植物體內(nèi)不能積累有效的siRNA[25,26]，或通過抑制AGO切割活性[27]等機制來抑制植物中VIGS。因此，siRNA的積累和AGO具有的酶切的功能在VIGS作用機制中起著關(guān)鍵性的作用。

3 病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的優(yōu)點及局限性

要確定一個基因的功能，最直接有效的辦法就是抑制該基因的表達或構(gòu)建功能性基因的突變體，然后觀察其表型的變化。目前已有的用于功能喪失（Loss-of-function）研究的方法主要包括化學(xué)突變分析，轉(zhuǎn)座子或農(nóng)桿菌T-DNA插入突變分析。這些方法在擬南芥的基因功能研究中非常有效，但在其他植物中尚未能大規(guī)模的應(yīng)用[28]。傳統(tǒng)的研究植物基因功能的方法是利用轉(zhuǎn)基因的方法將目的基因進行插入突變，觀察突變體和野生型的表型的差異。這種方法涉及到植物的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因后代的鑒定篩選，周期比較長。VIGS克服了傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中的困難，可在未知目的基因全序列的情況下進行基因的沉默。它不僅可以以EST序列或者以某一個基因的片段為對象進行功能鑒定，也可以以cDNA文庫為對象進行目的基因篩選分析。其次，VIGS的整個操作過程簡便，能夠在沉默植株的當(dāng)代獲取目的基因功能喪失的表型，而無需大規(guī)模篩選突變體。一般從構(gòu)建重組載體到農(nóng)桿菌侵染植物進行功能鑒定僅需幾個星期，因此既節(jié)省時間又節(jié)省人力和物力，可以較大規(guī)模的進行基因組序列的功能鑒定，適用于高通量基因文庫的篩選。

但是VIGS在基因功能研究的過程中也存在一些局限性。VIGS所用的病毒載體大部分集中在模式植物普通煙、本生煙和擬南芥上，許多適用于糧食作物和經(jīng)濟作物的目的基因沉默的病毒載體還沒有開發(fā)出來。此外，有些病毒侵染植物后引起的病毒癥狀比較嚴(yán)重，從而干擾沉默植株的表型，給鑒定工作帶來一定的困難。與傳統(tǒng)基因敲除的方法不同，VIGS是將目的基因的表達量下調(diào)，而當(dāng)目的基因下調(diào)量不能達到一定的比例時，仍然余留的目的基因表達有可能干擾最終的實驗結(jié)果。其次，VIGS系統(tǒng)對環(huán)境條件的要求極為嚴(yán)格，如有低溫和高濕的條件下才可以在番茄中明顯的觀察到目標(biāo)基因沉默的效果。再者，病毒誘導(dǎo)的內(nèi)源基因沉默一般在2～4周是觀察表型的最佳時期，隨著時間的推移，病毒載體上的植物基因片段會逐漸的丟失，沉默表型逐漸減弱或消失。因此，在有的植物上研究者能夠觀察到的VIGS導(dǎo)致的異常表型的時間相對較短，從而給后續(xù)的研究帶來一定的困難。

4 病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）的應(yīng)用

4.1 VIGS在植物基因功能研究中的應(yīng)用

VIGS技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域越來越廣泛，目前，應(yīng)用最多的是鑒定植物中的功能基因。有研究表明，VIGS在植物體的各種組織和器官中可誘導(dǎo)目標(biāo)基因沉默，如TRV載體能夠在番茄植株的多個部位產(chǎn)生沉默效果，如葉片、花[29]、果實[17]。宋偉杰等[30]利用一種基于PEBV的VIGS載體研究一個豌豆PI同源基因的功能，發(fā)現(xiàn)豌豆在其PsPI基因沉默后出現(xiàn)了類似擬南芥pi突變體、金魚草glo突變體的表型即導(dǎo)致其花瓣向萼片以及雄蕊向心皮轉(zhuǎn)變。Holzberg等[31]以大麥條花葉病毒為載體，成功的誘導(dǎo)了大麥葉片中PDS基因沉默。這是目前唯一的將VIGS應(yīng)用于單子葉植物的報道。眾多的研究表明VIGS技術(shù)是研究植物基因功能快速有效的方法，尤其是對于一些轉(zhuǎn)化困難的非模式植物的基因功能的研究更為重要。

4.2 VIGS在植物抗病機制領(lǐng)域的應(yīng)用

植物抗病相關(guān)基因的鑒定和分離是VIGS目前應(yīng)用比較活躍的領(lǐng)域之一，尤其是在研究符合基因?qū)驅(qū)W說的抗性相關(guān)基因的功能方面已有很多報道，這主要是得益于多數(shù)符合基因?qū)驅(qū)W說的抗性基因編碼產(chǎn)物，能夠與其對應(yīng)的無毒基因編碼的產(chǎn)物互作并表現(xiàn)出明顯的過敏性壞死反應(yīng)（Hypersensitive response,HR）。由于不同寄主植物種類間R/Avr互作后引起的下游信號傳導(dǎo)途徑相對保守，將互補的R/Avr基因?qū)Ψ謩e克隆到雙元表達載體后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并導(dǎo)入植物葉片，或?qū)⒈磉_Avr的農(nóng)桿菌或病原菌本身導(dǎo)入含互補R基因的寄主植物，均可導(dǎo)致R/Avr誘發(fā)的HR壞死反應(yīng)。通過比較野生型VIGS和VIGS植株的HR壞死病斑大小和數(shù)量，即可確定被沉默基因在R/Avr誘發(fā)產(chǎn)生HR中的作用。根據(jù)該思路，大量抗性基因在多個R/ Avr互作中，包括Pto/AvrPto、Rx/PVX、N/TMV、Cf/Avr等誘導(dǎo)的HR反應(yīng)的功能已得到鑒定[20]。如Slamaker等[32]利用PVX載體制煙草葉綠體中一個碳酸纖酶（CA）基因的表達，結(jié)果表明寄主煙草中Pto: avrPto介導(dǎo)的免疫抗性被抑制。崔艷紅等[33]利用VIGS技術(shù)在煙草中沉默已知的抗病信號傳導(dǎo)路徑中的關(guān)鍵基因如SIPK、NDR1、SGT1、HSP90、NPR1、Rar1、EDS1、WRK Y1，同時瞬時表達馬鈴薯抗病基因RB和R3a與其相應(yīng)的無毒基因RBAvrblb1和R3a-AvR3a，根據(jù)HR反應(yīng)是否被阻斷來研究RB和R3a所介導(dǎo)的抗病機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGT1和HSP90基因沉默阻斷了RB和R3a介導(dǎo)的HR反應(yīng)，表明SGT1和HSP90是RB和R3a抗病信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因。擬南芥中，研究者利用TRV沉默體系研究植物防御反應(yīng)通路相關(guān)基因的功能，發(fā)現(xiàn)這些基因與植物中抗丁香假單胞菌基因R的產(chǎn)物RPS2轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號途徑相關(guān)[34]。在大麥中，利用BSMV介導(dǎo)的VIGS轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，證明了Rar1、Sgt1和Hsp90等抗病基因在小麥抗葉銹病基因Lr21以及大麥抗白粉病基因Mlal3介導(dǎo)的抗性途徑中均起著非常重要的作用[23-24]。

VIGS除了應(yīng)用于符合基因?qū)驅(qū)W說的抗性相關(guān)基因功能的鑒定和篩選外，還被用于鑒定其他類型和抗病性以及防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的功能[20]。如植物中Ca依賴蛋白激酶（CDPK）被認(rèn)為在植物抗病反應(yīng)中起重要作用，Romeis等[34]從煙草中分離了兩個CDPK的cDNA并利用VIGS對其中一個在煙草中的功能進行了驗證。結(jié)果表明CDPK被抑制的植物表現(xiàn)出超過敏反應(yīng)滯后的癥狀，且沒有萎蔫表型。李亞軍等[35]利用VIGS技術(shù)，在本氏煙草（Nicotina benthamiana）中成功沉默了兩個馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)的基因片段EL732276和EL732318，并證明了這兩個基因在馬鈴薯廣譜抗性建立過程中的作用。總之，VIGS系統(tǒng)在研究某些抗病基因的功能，解析植物抗病信號路徑過程中發(fā)揮著越來越重要的作用。

4.3 VIGS在其它研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

VIGS除了應(yīng)用于植物功能基因組和植物抗病機制研究領(lǐng)域外，還被應(yīng)用于作物品種的改良。如果作物中存在有人們不希望表達的內(nèi)源基因，就可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和病毒載體，將人工構(gòu)建的具有反向重復(fù)的核內(nèi)源基因的片段導(dǎo)入宿主細胞中，從而使該基因沉默，這一技術(shù)多用于作物品種性狀的改良等領(lǐng)域。此外，將植物易感的病毒基因片段整合到宿主染色體上，這樣當(dāng)該病毒或與該病毒有親緣關(guān)系的其它病毒侵染植物后，植物可通過PTGS防衛(wèi)機制降解病毒RNA，從而增加植物的抗病性[36]。另外，VIGS還被應(yīng)用于抗蟲信號傳導(dǎo)途徑中，植物為保護自己免受食草動物攻擊而產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)或有毒物質(zhì)來防御昆蟲的危害。煙草中的尼古丁可直接殺死不適應(yīng)于尼古丁的食草動物或抑制適應(yīng)于尼古丁的食草動物的生長。利用VIGS技術(shù)沉默煙草中由茉莉酸介導(dǎo)的尼古丁防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因，外源茉莉酸處理后引起尼古丁升高[37]，從而達到抵抗食草動物取食的作用；抗旱信號傳導(dǎo)途徑中，研究者利用VIGS方法，沉默與乙醇脫氫酶具有同源性的黃酮醇3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（F3OGT），與對照相比沉默植物表現(xiàn)明顯的萎蔫癥狀[38]。此外，VIGS技術(shù)還在植物細胞中的合成和代謝路徑如甾醇合成途徑[32]、光合作用途徑[33]、以及纖維素合成途徑[34]的研究得到廣泛的應(yīng)用。

5 VIGS技術(shù)的前景展望

21世紀(jì)的分子生物學(xué)已經(jīng)進入后基因組時代，植物功能基因研究已成為植物分子生物學(xué)研究的熱點。但是由于植物的生長周期長，傳統(tǒng)的植物基因功能研究方法越來越不能滿足植物功能基因組研究。而病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)具有簡單、快速、高通量等優(yōu)點，可望解決植物基因功能研究周期長的瓶頸問題。近年來，由于技術(shù)的優(yōu)越性，VIGS越來越多地被用于植物生物學(xué)許多領(lǐng)域分子機理的研究，顯示出作為基因鑒定和功能分析工具的巨大潛力。今后幾年有關(guān)VIGS的研究和應(yīng)用至少包括以下幾個方面：首先，拓寬更廣泛的植物寄主范圍、大規(guī)?；蚝Y選和鑒定分析、建立更高效的VIGS體系等。主要是在原有載體基礎(chǔ)上進行的改進或者通過改進載體導(dǎo)入方法、植物培育條件等措施拓寬現(xiàn)有載體系統(tǒng)的適用植物寄主范圍。其次，如何獲得目標(biāo)基因的系統(tǒng)性沉默仍然是VIGS技術(shù)目前需要解決的問題。目前的研究發(fā)現(xiàn)，VIGS雖然可以引發(fā)目標(biāo)基因的系統(tǒng)性沉默，但植株各個部位的沉默效率往往表現(xiàn)出不一致性，即有些部位沉默效率很高，但有些部位只有輕微的沉默表型。第三，目的基因沉默持續(xù)的時間長短的問題。目前的研究發(fā)現(xiàn)，VIGS持續(xù)的時間可達到2~3個月，這對于生長周期較長的植物顯然還不夠，因此需要通過病毒載體的選擇或改造來增強病毒的活性，從而延長VIGS的作用時間和增強目標(biāo)基因的沉默效果，可能是今后值得嘗試的工作。綜上所述我們認(rèn)為今后VIGS技術(shù)必將在更多的植物物種中得到應(yīng)用，并將成為植物功能基因組學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的技術(shù)。

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Progress in Study of Plant Resistance Gene Function Using Virus Induced Gene Silence System

ZHANG Xiaoluo,ZHAO Jun＊
(College of Agronomy,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot,Inner Mongolia 010018,China)

Virus induced gene silence（VIGS）is a naturalmechanism,which was used by plants to resistthe virus invasion. Now,it has been developed into a popular genetic technique to suppress the endogenous gene expression by recombinant viruses which contain the fragment of target genes.As a novel tool to unravel the candidate gene's function,VIGS has many advantages such as unnecessarily knowing the full-length sequence of the target gene in advance,quick acquisition of phenotype,and unnecessarily obtaining the transgenic plant.Now,it has been widely used in the field of plant gene function studies.In this review,we summarized the research progress in VIGS mechanism,the advantages and limitations of VIGS system and its application to studying the plantresistance gene's function.

VIGS;plant resistance;gene function

S532

A

1672－3635（2013）03-0181-06

2013-04-17

國家自然科學(xué)基金項目，水楊酸在馬鈴薯小G蛋白StRac介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)體系建立過程中的功能初探（31260425）。

張曉蘿（1987-），女，碩士研究生，研究方向為分子植物病理。

趙君，教授，主要從事馬鈴薯、向日葵病害研究，E-mail:zhaojun02@hotmail.com。