楊 靜,楊秀竹,劉洪斌
天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所(天津 300100)
膽汁由肝細(xì)胞分泌,膽管上皮細(xì)胞對(duì)膽汁的形成有調(diào)節(jié)作用。原纖毛是膽管上皮細(xì)胞的一個(gè)細(xì)胞器,近年來(lái)研究始發(fā)現(xiàn)膽管上皮細(xì)胞原纖毛可以發(fā)揮感受器的作用,影響膽汁的分泌[1]?,F(xiàn)代研究逐漸認(rèn)識(shí)到,在某些肝臟疾病中,膽管上皮細(xì)胞發(fā)揮了重要的作用[2]。保護(hù)膽管上皮細(xì)胞及其功能是一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)。我們利用膽管結(jié)扎方法制備了肝外淤膽大鼠模型,并觀察了淤膽時(shí)膽管上皮細(xì)胞原纖毛形態(tài)上的變化。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性Wistar大鼠15只,由天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司中心提供,合格證號(hào)SCXK(津)2009-0001,體質(zhì)量(250±30)g。隨機(jī)平均分為3 組:正常對(duì)照組(ratsctr)、膽管結(jié)扎7 d 組(ratsL7)、膽管結(jié)扎10 d組(ratsL10)。
1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 動(dòng)物手術(shù)顯微鏡,電子天平(SARTORINS,德國(guó)),手術(shù)器械。
1.3 相關(guān)試劑 多聚甲醛,戊二醛,平衡鹽溶液,生理鹽水,美藍(lán)。
1.4 模型制備與樣品處理方法 參照文獻(xiàn)報(bào)道[3]采用膽管結(jié)扎制備膽汁淤積模型。三組大鼠全身肝素化后用生理鹽水清除肝臟內(nèi)血液;之后行膽總管插管,灌注固定液,約10 min后至肝臟變?yōu)榛野咨?,離斷肝臟,2%戊二醛固定,送檢電鏡。
1.6 檢測(cè)指標(biāo) 南開大學(xué)電鏡中心行掃描電鏡分別觀察大膽管(直徑>100 μm)和小膽管(直徑<50 μm)的膽管上皮細(xì)胞原纖毛形態(tài)特點(diǎn)。
2.1 纖毛長(zhǎng)度的變化 正常大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞原纖毛的長(zhǎng)度因膽管直徑不同而有所差異。大膽管原纖毛的長(zhǎng)度為(7.76±1.14)μm。淤膽后,ratsL7組原纖毛長(zhǎng)度變得不規(guī)則,90%以上明顯變短,小于10%的原纖毛長(zhǎng)度仍> 6 μm,平均長(zhǎng)度為(2.92±1.39)μ m;ratsL10組,原纖毛長(zhǎng)度變短至(2.34±0.37)μm。小膽管有明顯的微絨毛結(jié)構(gòu),其原纖毛長(zhǎng)度約(5.15±0.89)μm。正常大鼠膽管上皮細(xì)胞原纖毛平整伸展入膽管腔內(nèi)。淤膽后,ratsL7組原纖毛頂端普遍發(fā)生卷曲,未卷曲主干部分長(zhǎng)度為(2.52±0.96)μm。ratsL10組,卷曲的原纖毛數(shù)量明顯減少,長(zhǎng)度縮短至(2.31±0.53)μm。(結(jié)果見圖1,表1)
2.2 纖毛數(shù)量的變化 經(jīng)掃描電鏡10 000倍放大,大膽管ratsctr組每個(gè)視野中原纖毛的數(shù)量為(12±3)根。在選取的觀察點(diǎn),原纖毛的數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著的增加:ratsL7組為每視野(87±12)根,ratsL10組為每視野(197±46)根,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小膽管原纖毛數(shù)量的變化與大膽管相似:與ratsctr組相比,ratsL7組有所增加,每視野由(4±1)根增至(16±2)根,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ratsL10組原纖毛數(shù)量與ratsctr組相比也有顯著增加,每視野由(4±1)根增至(15±3)根,但與ratsL7組相比無(wú)明顯差異。(結(jié)果見圖2,表2)
圖1 膽汁淤積前、后膽管上皮細(xì)胞原纖毛形態(tài)的變化(掃描電鏡)
表1 膽汁淤積對(duì)原纖毛長(zhǎng)度的影響
表2 膽汁淤積對(duì)原纖毛數(shù)目的影響
膽管上皮細(xì)胞在肝臟的多種疾病中發(fā)揮著重要的病理作用。膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cell,BEC)約占肝臟細(xì)胞總數(shù)的3%~5%,它們襯覆著肝內(nèi)的一個(gè)復(fù)雜的、相互聯(lián)系的網(wǎng)狀導(dǎo)管結(jié)構(gòu),包括毛細(xì)膽管、小葉間膽管、左右肝管,稱為肝內(nèi)膽管系統(tǒng)(IHBDS)。同時(shí),膽管上皮細(xì)胞也襯覆著肝外膽管。BEC 在水、電解質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮的作用已得到證實(shí)。原纖毛作為膽管上皮細(xì)胞的一個(gè)重要的細(xì)胞器,理應(yīng)引起足夠的重視。研究證實(shí)纖毛形態(tài)的不同伴隨著功能的不同[4-6]。
結(jié)扎膽總管是制作梗阻性膽汁淤積模型的常用方法。而膽管增生(膽小管反應(yīng))被認(rèn)為在膽源性肝纖維化的啟動(dòng)和發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)結(jié)扎膽總管致肝外淤膽時(shí)大膽管與小膽管上皮細(xì)胞原纖毛的形態(tài)與正常大鼠相比有所不同:
首先是纖毛長(zhǎng)度的變化。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1],正常大鼠大膽管上皮細(xì)胞原纖毛的長(zhǎng)度要長(zhǎng)于小膽管上皮細(xì)胞原纖毛,本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。淤膽7 d,絕大多數(shù)(90%以上)的大膽管上皮細(xì)胞原纖毛長(zhǎng)度顯著縮短,小于10%的原纖毛仍保持原長(zhǎng)度;至淤膽10 d,全部的大膽管上皮細(xì)胞原纖毛均縮短至2~3 μm。小膽管上皮細(xì)胞原纖毛的變化與之不同,淤膽7 d 時(shí),原纖毛頂端發(fā)生了卷曲;淤膽10 d,卷曲的原纖毛數(shù)量明顯減少,長(zhǎng)度與ratsL7組未卷曲的主干部位一致??赏茰y(cè),淤膽時(shí),小膽管上皮細(xì)胞感受著物理(壓力)滲透壓、化學(xué)及生物性的不同刺激,原纖毛可能發(fā)生了斷裂,導(dǎo)致其長(zhǎng)度變短,大膽管上皮細(xì)胞原纖毛未見此變化,可能與時(shí)間點(diǎn)的選擇有一定關(guān)系。
其次是纖毛數(shù)量的變化。膽汁淤積7 d 后,大膽管上皮細(xì)胞原纖毛數(shù)量明顯增加。淤膽10 d,原纖毛數(shù)量的增加更加明顯。小膽管上皮細(xì)胞原纖毛增加的程度稍弱,推測(cè)某種程度上與膽總管梗阻模型的病理進(jìn)程有關(guān)。結(jié)扎膽總管遠(yuǎn)端后,膽汁淤積在膽總管和肝臟內(nèi),造成肝外膽總管近端極度膨大,肝內(nèi)膽管靠近肝門處的一級(jí)分支增粗了十?dāng)?shù)倍,這一趨勢(shì)隨淤膽時(shí)間延長(zhǎng)而愈加明顯。而在肝臟內(nèi)部,因?yàn)橛懈闻K細(xì)胞與組織的支撐,肝內(nèi)膽管的后級(jí)分支感受到的壓力要逐級(jí)遞減。所以膽汁淤積程度不同,給予各級(jí)膽管的刺激也不同,這可能是原因之一。
綜上所述,淤膽后,膽管上皮細(xì)胞原纖毛具有特殊形態(tài)的原因可能是:在不同直徑的膽管中,纖毛發(fā)揮著不同的作用;此外還可能與結(jié)扎膽總管所造成的肝外淤膽的病理進(jìn)程有關(guān),即在我們選擇的觀察時(shí)間點(diǎn),大、小膽管受累的程度不同,因而其變化可能具有時(shí)效性。若縮短觀察的間隔時(shí)間,大、小膽管上皮細(xì)胞原纖毛是否會(huì)發(fā)生同樣的變化,原纖毛在感受膽汁淤積所造成的壓力和化學(xué)變化中又具體發(fā)揮了怎樣的作用,這將會(huì)是一個(gè)值得深入研究的課題。
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