非結(jié)核分枝桿菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展

黃明翔

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）是指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、肯尼迪分枝桿菌、山羊分枝桿菌、海豹分枝桿菌）及麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。NTM廣泛存在于水、土壤、灰塵等自然環(huán)境中，人主要從環(huán)境中的水、土壤和微生物氣溶膠感染NTM而患病，目前沒(méi)有NTM在動(dòng)物與人及人與人之間傳播的證據(jù)。NTM可以侵犯人體肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等組織器官并可引起全身播散性疾病［1］。NTM 原屬于環(huán)境中的腐生菌和引起人類(lèi)機(jī)會(huì)感染的條件致病菌，直到1980年鳥(niǎo)分枝桿菌廣泛的從艾滋病患者中分離出來(lái)后，NTM才真正為大家所重視［2］。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)NTM菌種154種，13個(gè)亞種，其中40多種對(duì)人體致?。?－6］。

近年來(lái)，NTM病的發(fā)病率、患病率在一些國(guó)家和地區(qū)呈上升趨勢(shì)，在某些發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，結(jié)核病的疫情呈下降趨勢(shì)而NTM病呈上升趨勢(shì)［7－9］。我國(guó)NTM的分離率也呈現(xiàn)逐年增加的態(tài)勢(shì)［10］。NTM菌種分布具有明顯地域差異，我國(guó)由于南北方氣候差異，各地NTM菌種分布也不盡相同。NTM的感染率呈現(xiàn)出南方高于北方，沿海高于內(nèi)地，氣候溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū)的流行特點(diǎn)［11－14］。由于NTM病與結(jié)核病相比無(wú)臨床特異性，耐藥率高，致病菌種繁多，菌種鑒別困難。

目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于分枝桿菌菌種鑒定主要還是采用以伯杰細(xì)菌分類(lèi)鑒定系統(tǒng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)鑒定方法［1］，但是傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分類(lèi)、鑒定系統(tǒng)主要以形態(tài)和生理生化特征的綜合指標(biāo)為依據(jù)，存在很大的異質(zhì)性，也不能揭露生物間的進(jìn)化關(guān)系。而且操作繁雜、費(fèi)時(shí)，鑒定一種分枝桿菌菌種費(fèi)時(shí)約4周，不適于臨床快速診斷的要求，有其局限性。近年來(lái)，免疫層析技術(shù)、色譜技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)的介入，使NTM的實(shí)驗(yàn)室診斷水平有了較大的進(jìn)展。

以下僅對(duì)近幾年NTM實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)展情況進(jìn)行綜述。

一、免疫層析技術(shù)

免疫層析（immunochromatography，IC）是20世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來(lái)的將免疫標(biāo)記技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合的一種新型檢測(cè)技術(shù)。它的原理是：借助毛細(xì)作用使待檢樣品在層析條上泳動(dòng)，其中的待測(cè)物與層析條上針對(duì)待測(cè)物的受體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，此受體被顯色標(biāo)志物標(biāo)記。在層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測(cè)帶），而游離的顯色標(biāo)志物標(biāo)記的受體則越過(guò)檢測(cè)帶，與免疫復(fù)合物自動(dòng)分離，并在后續(xù)的層析過(guò)程中被富集或截留在層析材料的另一區(qū)域（質(zhì)控帶）。通過(guò)目測(cè)檢測(cè)帶和質(zhì)控帶的顏色，從而實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)待測(cè)物的目的［15］。

MPB64抗原膠體金法是免疫層析技術(shù)中的一種重要方法，往往用于NTM的初步鑒定。其利用MPB64蛋白（結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的主要分泌蛋白之一）在NTM中僅有極少數(shù)存在的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。該方法應(yīng)用免疫層析技術(shù)通過(guò)膠體金標(biāo)記的抗MPB64單克隆抗體檢測(cè)分枝桿菌培養(yǎng)物中是否含有MPB64蛋白［16］。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)表明培養(yǎng)物中含有MPB64蛋白，即可判定此分枝桿菌菌種為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，結(jié)果為陰性時(shí)可判定菌種為NTM。

膠體金法快速、簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器，只需15min便能得到結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道該法的敏感度為95．8%、特異度為97．4%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）為98．2%、陰性預(yù)測(cè)值（NPV）為94．2%，與基因探針?lè)ㄏ啾扔泻芨叩姆闲裕?7］。但該法僅能用于NTM的初步鑒定，無(wú)法對(duì)NTM菌種進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

二、色譜技術(shù)

應(yīng)用色譜方法分析特定菌體成分（如脂肪酸、分枝菌酸等）特性，進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，是目前常用的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)之一。色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。分離后的組分按保留時(shí)間的先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器根據(jù)組分的物理化學(xué)性質(zhì)將組分按順序檢測(cè)出來(lái)并形成各組分的色譜峰；最終依據(jù)樣本中各組分保留時(shí)間（出峰位置）進(jìn)行定性分析或依據(jù)響應(yīng)值（峰高或峰面積）對(duì)試樣中各組分進(jìn)行定量分析。

色譜法主要包含的方法有：柱色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，其中氣相色譜法、高效液相色譜法是可以進(jìn)行定量分析的色譜法。色譜法在藥物分析、微生物檢測(cè)等醫(yī)療領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著將光譜技術(shù)引入色譜，如進(jìn)行色譜－質(zhì)譜連用、色譜－紅外光譜連用、色譜－紫外光譜連用等，使得在分離化合物的同時(shí)即可測(cè)定化合物的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，色譜檢測(cè)器的發(fā)展還伴隨著數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)獲得的數(shù)據(jù)隨即進(jìn)行計(jì)算處理，使研究者獲得更多信息［18］。

分枝桿菌細(xì)胞壁中含有豐富的分枝菌酸（mycolic acid，MA）。MA是一類(lèi)復(fù)雜的高分子量物質(zhì)，含有長(zhǎng)α－烷基鏈、β－羥基脂肪酸，是所有分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)的主要組分，其脂肪酸上碳鏈的長(zhǎng)度、不飽和狀態(tài)、官能團(tuán)及含量在各生物種型之間呈現(xiàn)指紋特征的特點(diǎn)。因此，色譜分析即以此為基礎(chǔ)，通過(guò)分析比較分枝桿菌中MA之間的差異，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定［19］。

1．氣相色譜技術(shù)：Torkko等［20］采用氣相色譜分析全細(xì)胞脂肪酸對(duì)緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)證實(shí)，該技術(shù)和傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)果具有良好的一致性，是一種準(zhǔn)確度高、實(shí)用性強(qiáng)的分枝桿菌菌種鑒定方法。國(guó)內(nèi)劉志輝等［21］應(yīng)用氣相色譜技術(shù)對(duì)14株分枝桿菌參考菌株和727株分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定，同時(shí)采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行比對(duì)，認(rèn)為氣相色譜技術(shù)和傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)果具有良好的一致性，且可通過(guò)一次性實(shí)驗(yàn)操作將臨床中常見(jiàn)的分枝桿菌鑒定到種。

2．高效液相色譜技術(shù)：通過(guò)將分枝桿菌皂化、提取 MA、衍生化為溴代苯甲酰脂肪酸酯而進(jìn)行高效液相色譜技術(shù)分析，對(duì)分枝桿菌的鑒別可達(dá)種間水平。陳保文等［19］應(yīng)用反相高效液相色譜法將44株NTM標(biāo)準(zhǔn)株準(zhǔn)確鑒定出42株，僅愛(ài)知分枝桿菌和羅德島分枝桿菌無(wú)法鑒別。

應(yīng)用色譜法進(jìn)行NTM菌種鑒定，具有檢測(cè)時(shí)間短、方法穩(wěn)定可靠、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但該法需借助較昂貴的儀器來(lái)完成，操作復(fù)雜對(duì)操作人員技術(shù)要求高，且不能鑒別出新的NTM菌種。

三、分子生物學(xué)技術(shù)

近年應(yīng)用以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法鑒定分枝桿菌菌種已在國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展。結(jié)果均證實(shí)分子生物學(xué)方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異地將大多數(shù)分枝桿菌鑒定到種，優(yōu)于傳統(tǒng)方法，對(duì)提高分枝桿菌的正確診斷率、指導(dǎo)臨床合理用藥有重要意義［22－23］。

1．基因探針技術(shù)：基因探針技術(shù)包括以德國(guó)HAIN Lifescience公司的HAIN test為代表的DNA探針技術(shù)和以美國(guó)Gene Probe公司的AccuProbe技術(shù)為代表的RNA探針技術(shù)，同時(shí)還包括基因芯片技術(shù)。

HAIN test應(yīng)用生物素標(biāo)記的特異性探針，探針序列為各種標(biāo)準(zhǔn)菌株23SrRNA的特異序列，標(biāo)記的探針通過(guò)與親和素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交顯色后，不同NTM菌種會(huì)在試紙條上出現(xiàn)特定的條帶，最后通過(guò)條帶顯色的差異區(qū)分不同的菌種類(lèi)別［24］。該試劑包括常見(jiàn)NTM HAIN基因分型試劑盒（CM）和非典型NTM HAIN基因分型試刺盒（AS）兩種，CM試紙能鑒定臨床最常見(jiàn)的15種NTM，如鳥(niǎo)－胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌等；AS試紙能鑒定臨床致病較少見(jiàn)的NTM，如恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、胃分枝桿菌等。有文獻(xiàn)顯示：CM試紙的敏感度和特異度分別為97．0%和92．4%，AS試紙的敏感度和特異度分別為99．3%和99．4%［24］。這種方法鑒定操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，整個(gè)鑒定過(guò)程只需2～4h，能及時(shí)地為臨床提供準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。但該法成本稍高，且臨床上比較少見(jiàn)的NTM如地分枝桿菌、金色分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌等無(wú)法鑒定。

AccuProbe技術(shù)以rRNA為擴(kuò)增的目標(biāo)核酸，采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)、雜交保護(hù)檢測(cè)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光多種敏感的分子技術(shù)。目前，AccuProbe可鑒定的菌種包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、鳥(niǎo)分枝桿菌、戈登分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌。文獻(xiàn)報(bào)道：AccuProbe檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的敏感度為95．7%，特異度為100．0%，可以對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與NTM的快速鑒別，同時(shí)能夠鑒定3種常見(jiàn)的NTM菌種。該法快速、準(zhǔn)確，且由于RNA只存在于活的細(xì)菌內(nèi)，陽(yáng)性結(jié)果提示標(biāo)本中存在活的分枝桿菌，克服了DNA 檢測(cè)的不足［25］。

基因芯片檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)是將核苷酸靶序列與大量結(jié)合在玻璃片、硅片、塑料片或膜上的探針雜交，再通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)或酶顯色系統(tǒng)顯示結(jié)果，從而迅速得出所要的信息。其結(jié)果具有多樣品、高通量、大規(guī)模、平行性等特點(diǎn)。研究報(bào)道：以傳統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定方法為對(duì)照，應(yīng)用DNA芯片技術(shù)對(duì)134株臨床分離株進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果兩種方法鑒定結(jié)果一致和基本一致共112株，吻合率為83．6%［26］，提示DNA芯片檢測(cè)技術(shù)可以簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地將大多數(shù)分枝桿菌鑒定到種。

2．限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR－RFLP）技術(shù)：PCR－RFLP通過(guò)PCR擴(kuò)增靶基因序列，產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，電泳后獲得酶切指紋圖譜而鑒定菌種。常用的分子標(biāo)識(shí)有 gyrB、16S－23SrRNA ITS、hsp65、rpoB 等。用PCR－RFLP方法分析hsp65基因和rpoB基因，能夠?qū)⒎种U菌鑒定到種的水平。hsp65基因PCR產(chǎn)物分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BstPⅠ和HaeⅢ酶切，rpoB基因PCR產(chǎn)物分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspⅠ和HaeⅢ酶切，產(chǎn)生大小不一的片段，在高分辨率瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)不同的指紋圖譜，從而判定其菌種類(lèi)型。Ong 等［27］分別用 PRA－h(huán)sp65和 PRA－rpoB對(duì)90株NTM 進(jìn)行鑒定，PRA－h(huán)sp65鑒定出92．2%和PRA－rpoB鑒定出86．7%的菌種，其中對(duì)47株NTM快生菌，PRA－h(huán)sp65和PRA－rpoB分別鑒定出89．4%和95．7%，對(duì)23株 NTM 慢生菌，分別鑒定出91．3%和52．5%，提示PRA－h(huán)sp65比PRA－rpoB的鑒定效能優(yōu)越，特別是對(duì)慢生菌鑒定。此技術(shù)用于NTM的鑒定有效、快速、方便，成本也較低；對(duì)于比較相近的菌株如龜分枝桿菌復(fù)合群、堪薩斯分枝桿菌復(fù)合群、偶然分枝桿菌以及戈登分枝桿菌復(fù)合群等，此種方法也能容易區(qū)分。盡管如此，此種方法仍存在一定的缺陷：（1）缺少標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的操作方法，不同的實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)會(huì)因?yàn)榉椒▽W(xué)的差異而導(dǎo)致結(jié)果上的差異；（2）缺乏標(biāo)準(zhǔn)的酶切產(chǎn)物條帶數(shù)據(jù)庫(kù)，Maker的差異或者主觀人為的判讀易導(dǎo)致結(jié)果的不同，不同的文獻(xiàn)報(bào)道酶切產(chǎn)物條帶有5～15bp的差異。

3．PCR－基因測(cè)序：DNA測(cè)序是基于核酸序列的鑒定方法中最直接可靠的方法。其中16SrRNA基因測(cè)序鑒定NTM快速準(zhǔn)確，是被研究確認(rèn)的鑒定分枝桿菌比較權(quán)威的方法，如今已廣泛應(yīng)用于分枝桿菌的鑒定［23］。NTM16S rRNA含有1500個(gè)核苷酸序列，分子結(jié)構(gòu)高度保守，核苷酸序列只在某些位置有少量的改變，這些位置的改變有分枝桿菌屬或種的特異性。Heller等［23］采用DNA焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)臨床分離分枝桿菌菌株16SrRNA核苷酸序列的超可變區(qū)A進(jìn)行分析，并與其他菌種鑒定方法進(jìn)行比較，其符合率達(dá)90%以上。

16SrRNA對(duì)親緣關(guān)系不密切的分枝桿菌菌種鑒定非?？煽浚H緣關(guān)系近的分枝桿菌菌種間16SrRNA基因多態(tài)性太低，相互之間無(wú)法區(qū)分開(kāi)來(lái)。將親緣關(guān)系近的分枝桿菌區(qū)分開(kāi)來(lái)需要選擇多態(tài)性更高的靶位基因。近年來(lái)，有研究選用16S－23SrRNA ITS、hsp65、rpoB等基因，也有選用glpK、argH、murC、gnd、cya管家基因進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定的研究報(bào)告［28］。單獨(dú)選用某一個(gè)靶標(biāo)的鑒定能力常常有限，甚至有時(shí)產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果，現(xiàn)多主張采用多靶位聯(lián)合使用的鑒定技術(shù)。直接測(cè)序簡(jiǎn)便易行，只需對(duì)分枝桿菌的特定基因進(jìn)行測(cè)序，并與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌種序列進(jìn)行同源性比較分析，即可得出結(jié)論，但是費(fèi)用太高，難以臨床推廣使用。

綜上所述，傳統(tǒng)經(jīng)典的方法常常作為新方法的參照，但由于其操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度較低，而難以廣泛開(kāi)展。隨著免疫層析技術(shù)、色譜技術(shù)、分子生物學(xué)等技術(shù)的介入，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了NTM菌種快速、準(zhǔn)確鑒定。自動(dòng)化設(shè)備及先進(jìn)方法的引進(jìn)，使NTM病的實(shí)驗(yàn)診斷前進(jìn)了一大步。但這些項(xiàng)目目前多處于科研階段，還未有成熟的方法在常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室充分的推廣應(yīng)用，直接影響臨床對(duì)NTM病的診斷。如何聯(lián)合應(yīng)用多種分類(lèi)鑒定方法，克服每項(xiàng)技術(shù)的局限性，進(jìn)而形成快速可靠、成本低廉的標(biāo)準(zhǔn)化體系是未來(lái)快速鑒定菌種的趨勢(shì)。

［1］唐神結(jié)，高文．臨床結(jié)核病學(xué)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011．

［2］Park YS，Lee CH，Lee SM，et al．Rapid increase of non－tuberculous mycobacterial lung diseases at a tertiary referral hospital in South Korea．Int J Tuberc Lung Dis，2010，14（8）：1069－1071．

［3］ Griffith DE．Nontuberculous mycobacterial lung diseases．Curr Opin Infect Dis，2010，23（2）：185－190．

［4］Griffith DE，Aksamit T，Brown－Elliott BA，et al．An official ATS／IDSA statement：diagnosis，treatment，and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases．Am J Respir Crit Care Med，2007，175（4）：367－416．

［5］朱紅軍，柯永堅(jiān)，林祥偉，等．剖宮產(chǎn)術(shù)后暴發(fā)切口膿腫分枝桿菌感染．中國(guó)感染控制雜志，2010，9（6）：393－395．

［6］Lillis JV，Ansdell D．Outbreak of nontuberculous mycobacterial disease in the central Pacific．Dermatol Clin，2011，29（1）：9－13．

［7］Winthrop KL，Varley CD，Ory J，et al．Pulmonary disease associated with nontuberculous mycobacteria，Oregon，USA．Emerg Infect Dis，2011，17（9）：1760－1761．

［8］Billinger ME，Olivier KN，Viboud C，et al．Nontuberculous mycobacteria－associated lung disease in hospitalized persons，United States，1998－2005．Emerg Infect Dis，2009，15（10）：1562－1569．

［9］Prevots DR，Shaw PA，Strickland D，et al．Nontuberculous mycobacterial lung disease prevalence at four integrated health care delivery systems．Am J Respir Crit Care Med，2010，182（7）：970－976．

［10］全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告．中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：485－508．

［11］王忠仁，張宗德，張本．非結(jié)核分枝桿菌病的流行趨勢(shì)．中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23（5）：263－265．

［12］景輝，王燕，李欣欣，等．山東省非結(jié)核分枝桿菌感染的菌種分布研究．中國(guó)防癆雜志，2009，31（5）：273－276．

［13］李昕潔，譚守勇，黃業(yè)倫，等．812株非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株流行病學(xué)特征分析．中國(guó)防癆雜志，2010，32（12）：811－814．

［14］Wang HX，Yue J，Han M，et al．Nontuberculous mycobacteria：susceptibility pattern and prevalence rate in Shanghai from 2005to 2008．Chin Med J（Engl），2010，123（2）：184－187．

［15］楊文勝，高明遠(yuǎn)，白玉白，等．納米材料與生物技術(shù)．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005．

［16］Bai Y，Xue Y，Gao H，et al．Expression and purification of Mycobacterium tuberculosis ESAT－6and MPT64fusion protein and its immunoprophylactic potential in mouse model．Protein Expr Purif，2008，59（2）：189－196．

［17］Shen GH，Chen CH，Hung CH，et al．Combining the Capilia TB assay with smear morphology for the identification of Mycobacterium tuberculosis complex．Int J Tuberc Lung Dis，2009，13（3）：371－376．

［18］蘇立強(qiáng)，鄭永杰．色譜分析法．北京：清華大學(xué)出版社，2009．

［19］陳保文，都偉欣，杜蓉，等．反相高效液相色譜法和16SrRNA序列分析法對(duì)分枝桿菌分型鑒別的比較研究．中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2012，7（4）：263－269．

［20］Torkko P，Katila ML，Kontro M．Gas－chromatographic lipid profiles in identification of currently known slowly growing environmental mycobacteria．J Med Microbiol，2003，52（Pt4）：315－323．

［21］劉志輝，蔡杏姍，竺澎波，等．應(yīng)用氣相色譜技術(shù)分析全細(xì)胞脂肪酸快速鑒定分枝桿菌．中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（6）：403－406．

［22］Sajduda A，Martin A，Portaels F，et al．hsp65PCR－restriction analysis（PRA）with capillary electrophoresis in comparison to three other methods for identification of Mycobacterium species．J Microbiol Methods，2010，80（2）：190－197．

［23］Heller LC，Jones M，Widen RH．Comparison of DNA pyrosequencing with alternative methods for identification of mycobacteria．J Clin Microbiol，2008，46（6）：2092－2094．

［24］Lee AS，Jelfs P，Sintchenko V，et al．Identification of non－tuberculous mycobacteria：utility of the GenoType Mycobacterium CM／AS assay compared with HPLC and 16SrRNA gene sequencing．J Med Microbiol，2009，58（Pt7）：900－904．

［25］Somoskovi A，Song Q，Mester J，et al．Use of molecular methods to identify the Mycobacterium tuberculosis complex（MTBC）and other mycobacterial species and to detect rifampin resis－tance in MTBC isolates following growth detection with the BACTEC MGIT 960system．J Clin Microbiol，2003，41（7）：2822－2826．

［26］黃明翔，王琳，張麗水，等．DNA芯片鑒定分枝桿菌的研究．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26（6）：555－557．

［27］Ong CS，Ngeow YF，Yap SF，et al．Evaluation of PCR－RFLP analysis targeting hsp65and rpoB genes for the typing of mycobacterial isolates in Malaysia．J Med Microbiol，2010，59（Pt11）：1311－1316．

［28］Macheras E，Roux A，Ripoll F，et al．Inaccuracy of single－target sequencing for discriminating species of the Mycobacterium abscessus group．J Clin Microbiol，2009，47（8）：2596－2600．