HIV感染與AIDS患者CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與肺結(jié)核主要癥狀體征的相關(guān)性研究

藍(lán)如束 趙錦明 成詩(shī)明 周林 趙雁林 林玫 羅丹 劉飛鷹

結(jié)核病（TB）是HIV感染與AIDS患者最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染和最主要的死亡原因之一［1］。全球約有30%的HIV感染者潛在感染了TB［2］。HIV是目前使?jié)摲黅B感染成為活動(dòng)性疾病的最大的風(fēng)險(xiǎn)因素［3］。HIV感染與AIDS患者合并結(jié)核病的雙重感染已成為目前預(yù)防控制和臨床診治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。CD4＋T淋巴細(xì)胞是HIV感染的主要受損細(xì)胞，其計(jì)數(shù)作為直接測(cè)定免疫功能的方法，是HIV感染者免疫系統(tǒng)損害狀況最明確的指標(biāo)。本研究通過(guò)對(duì)HIV感染與AIDS患者CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，探討其與結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)及肺結(jié)核主要癥狀、體征之間的相關(guān)性，旨在為臨床早期診斷HIV感染與AIDS患者合并肺結(jié)核提供參考。

資料和方法

一、患者來(lái)源

納入2010年7月至2012年6月期間在廣西CDC、廣西龍?zhí)夺t(yī)院、南寧市第四人民醫(yī)院就診登記并確診為HIV感染與AIDS患者共733例。其中男573例（占78．2%），女160例（占21．8%）。年齡為5～84歲，平均年齡（45．49±14．98）歲。職業(yè)以農(nóng)民為主，占62．8%（460／733）。臨床診斷合并活動(dòng)性肺結(jié)核患者290例，占39．6%（290／733），其中痰涂片陽(yáng)性患者37例；290例活動(dòng)性肺結(jié)核患者均按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化療方案進(jìn)行抗結(jié)核治療。X線胸片檢查提示肺部有異常陰影（X線胸片異常）的患者有668例。133例患者正接受抗病毒治療，占18．1%（133／733），接受抗病毒治療時(shí)間中位數(shù)為150d。結(jié)核病的相關(guān)診斷依照參考文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。

二、方法

1．儀器和試劑：全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)儀BacT／ALERT?3D240由法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)，F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀由美國(guó)BD公司生產(chǎn)；BacT／ALERT?3DMP處理瓶和分枝桿菌抗生素補(bǔ)充試劑盒（MB／BacT Antibiotic Supplement Kit）購(gòu)于法國(guó)梅里埃公司，CD4－APC試劑購(gòu)于美國(guó)BD公司，萋－尼染色液和改良中性羅氏培養(yǎng)基購(gòu)于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。H37Rv結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)CDC國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

2．臨床資料的采集：采用調(diào)查問(wèn)卷方式采集相關(guān)臨床資料，問(wèn)卷由中國(guó)CDC和廣西CDC專(zhuān)家共同設(shè)計(jì)，現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查由經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的2名醫(yī)務(wù)人員完成。1名醫(yī)務(wù)人員負(fù)責(zé)進(jìn)行面對(duì)面式詢(xún)問(wèn)調(diào)查并逐項(xiàng)填寫(xiě)問(wèn)卷，另1名醫(yī)務(wù)人員對(duì)信息進(jìn)行復(fù)核。調(diào)查內(nèi)容包括患者一般信息（如患者性別、年齡、婚姻狀況、職業(yè)等）、HIV感染與AIDS患者確診的相關(guān)信息、肺結(jié)核癥狀、體征等。

3．結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)：每例患者留3份痰（夜間痰、晨痰和即時(shí)痰），分別采用萋－尼染色方法進(jìn)行痰涂片找抗酸桿菌和BacT／ALERT?3D進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，操作步驟嚴(yán)格按文獻(xiàn)［5］和文獻(xiàn)［6］中的規(guī)定進(jìn)行。涂片采用萋－尼染色方法進(jìn)行染色鏡檢。分枝桿菌培養(yǎng)操作要求：選取2份痰涂片結(jié)果陽(yáng)性級(jí)別高或涂片結(jié)果陰性、痰質(zhì)量好的標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。取1～2ml標(biāo)本于50ml無(wú)菌離心管內(nèi)，加入1～2倍體積4%NaOH，液化去污染15min，加入磷酸鹽緩沖液（pH值為6．8）至50ml，擰緊蓋子漩渦振蕩混勻，3000×g離心15min，棄上清液后，加入1ml磷酸鹽緩沖液混勻，用1ml無(wú)菌注射器無(wú)菌操作吸取1ml混勻液，取0．5ml注入BacT／ALERT?3DMP處理瓶，放入BacT／ALERT?3D全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，陽(yáng)性結(jié)果儀器自動(dòng)報(bào)警，42d無(wú)菌落生長(zhǎng)則可報(bào)陰性結(jié)果。再按傳統(tǒng)方法接種0．1ml混勻液于2支改良中性羅氏培養(yǎng)基斜面，置于36℃恒溫培養(yǎng)，接種后第3、7天各觀察1次菌落生長(zhǎng)情況，此后每周觀察1次。如果有菌落生長(zhǎng)需進(jìn)一步做菌種鑒定，60d無(wú)菌落生長(zhǎng)報(bào)陰性結(jié)果。每批固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基均同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌“H37Rv菌株”作為質(zhì)控菌株。質(zhì)控方法和結(jié)果判斷，分別取0．5ml和0．1ml 1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝籋37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液接種到被測(cè)試液體培養(yǎng)和改良中性羅氏培養(yǎng)，按以上方法進(jìn)行培養(yǎng)。如果液體培養(yǎng)在7～10d內(nèi)生長(zhǎng)，改良羅氏培養(yǎng)在10～20d菌落生長(zhǎng)說(shuō)明培養(yǎng)基合格。

4．CD4＋T細(xì)胞的檢測(cè)：用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀進(jìn)行四色熒光抗體標(biāo)記檢測(cè)。采集患者靜脈全血約2～3ml，注入已加乙二胺四乙酸K3（EDTA－K3）抗凝劑的流式細(xì)胞檢測(cè)試管中，混勻，置室溫20～25℃。取20μl試劑于每個(gè)TruCOUNT管中，并用反向抽吸法準(zhǔn)確加入50μl待檢標(biāo)本，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。加入450μl的1×溶血素裂解液（FACS lysing solution），輕輕混勻，室溫避光放置15min，待紅細(xì)胞完全裂解，即可上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用Multi SET全自動(dòng)淋巴細(xì)胞免疫表型檢測(cè)分析軟件，對(duì)外周血直接多色熒光進(jìn)行分析，獲得關(guān)于外周血中淋巴細(xì)胞各類(lèi)亞型細(xì)胞的信息，經(jīng)分析軟件處理自動(dòng)算出檢測(cè)結(jié)果。

5．分枝桿菌的鑒定：采用結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原檢測(cè)膠體金法，抗酸桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物經(jīng)萋－尼染色鏡檢確認(rèn)為抗酸桿菌后，采用分枝桿菌抗原檢測(cè)膠體金法（MPB64）鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌。直接用1ml注射器吸取BacT／ALERT?3DMP處理瓶中液體100μl加入到結(jié)核分枝桿菌膠體金試驗(yàn)板的檢測(cè)孔中，15min后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽(yáng)性結(jié)果，判定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，后再經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸（PNB）、噻吩－2－羧酸酰肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基鑒別為結(jié)核分枝桿菌；在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶，而在檢測(cè)區(qū)未出現(xiàn)條帶則為陰性結(jié)果，判定為非結(jié)核分枝桿菌；如果質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)任何條帶說(shuō)明試劑失效，需重新檢測(cè)。每批試劑和鑒定培養(yǎng)基均同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌“H37Rv菌株”作為質(zhì)控菌株。MPB64試驗(yàn)板檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶，說(shuō)明試劑合格，反之失效。取0．1ml 1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝籋37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液接種到被測(cè)試PNB和TCH培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)30d。如果PNB無(wú)菌生長(zhǎng)，TCH有菌生長(zhǎng)說(shuō)明鑒定培養(yǎng)合格，反之不合格。

三、CD4＋T細(xì)胞分級(jí)

根據(jù)CD4＋T淋巴細(xì)胞數(shù)的多少分為4級(jí)［7－9］，1級(jí)：＞300個(gè)／μl；2級(jí)：200～300個(gè)／μl；3級(jí)：100～200個(gè)／μl；4級(jí)：＜100個(gè)／μl（因?yàn)檫M(jìn)行t檢驗(yàn)的兩樣本的總體方差不等，所以必須對(duì)CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變量變換后再進(jìn)行t檢驗(yàn)，以lg轉(zhuǎn)換取其自然對(duì)數(shù)。另外，本研究CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)的分級(jí)及進(jìn)行變量變換前的計(jì)數(shù)單位均為“個(gè)／μl”）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)資料采用EpiData 3．1軟件進(jìn)行雙錄入并核查，采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分級(jí)與痰培養(yǎng)陽(yáng)性的相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn)。對(duì)CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換后對(duì)其差異性進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)級(jí)別與痰培養(yǎng)陽(yáng)性的關(guān)系

733例HIV感染與AIDS患者中，分枝桿菌痰培養(yǎng)陽(yáng)性172例，其中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性118例，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為16．1%。不同CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)級(jí)別的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率見(jiàn)表1。經(jīng)檢驗(yàn)，不同CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)級(jí)別間結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2趨勢(shì)性＝2．004，P＝0．157）?；颊卟煌?jí)別CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果之間具有相關(guān)性（r＝－0．048，P＝0．035）。

表1 患者CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)級(jí)別與痰培養(yǎng)陽(yáng)性率的關(guān)系

二、CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與肺結(jié)核主要癥狀、體征的關(guān)系

對(duì)HIV感染與AIDS患者進(jìn)行CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且與是否咳嗽、咯痰＞2周、有無(wú)X線胸片異常、分枝桿菌痰培養(yǎng)結(jié)果，以及是否為活動(dòng)性肺結(jié)核等的差異進(jìn)行分析；結(jié)果顯示，HIV感染與AIDS患者是否咳嗽、咯痰＞2周中CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有咳嗽、咯痰＞2周癥狀的患者CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于無(wú)該癥狀的患者（P＝0．009）（表2）。

表2 有無(wú)肺結(jié)核主要癥狀、體征患者在CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)中的差異分析

討 論

HIV感染與AIDS患者的病情進(jìn)展可以促使肺結(jié)核感染的加速發(fā)展，而反過(guò)來(lái)肺結(jié)核也可以促使HIV感染者發(fā)展為AIDS患者［10］，兩者具有密切關(guān)系。CD4＋T淋巴細(xì)胞的高低可反映HIV感染與AIDS患者疾病的嚴(yán)重程度，并且AIDS患者T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)越少，并發(fā)結(jié)核病的可能性就會(huì)越大［11］。本研究對(duì)HIV感染與AIDS患者的CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)結(jié)果、肺結(jié)核主要臨床癥狀、X線胸片結(jié)果及有關(guān)臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，HIV感染與AIDS患者不同CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)級(jí)別間結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)級(jí)別與結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽(yáng)性率是具有相關(guān)性的。因此，對(duì)于CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較低的HIV感染與AIDS患者，在結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)結(jié)果出來(lái)之前，臨床上應(yīng)考慮其合并活動(dòng)性肺結(jié)核的可能，以便早期采取相應(yīng)的治療管理措施。HIV感染與AIDS患者結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽(yáng)性率較低，考慮可能與肺部病變很少發(fā)生組織破壞、少有空洞形成有關(guān)，但其常有菌血癥，發(fā)現(xiàn)肺外結(jié)核或進(jìn)行血液骨髓培養(yǎng)可提高診斷陽(yáng)性率［12］。

咳嗽、咯痰＞2周是肺結(jié)核患者最主要的臨床癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染與AIDS患者中出現(xiàn)咳嗽、咯痰＞2周者其CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于未出現(xiàn)該癥狀者。因此，對(duì)于出現(xiàn)該癥狀的HIV感染與AIDS患者，應(yīng)該警惕合并肺結(jié)核的可能。在臨床工作中，應(yīng)加強(qiáng)臨床監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)有無(wú)異常情況，以免延誤治療的最佳時(shí)期。

本研究結(jié)果顯示，HIV感染與AIDS患者中結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性和陰性的CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與患者選擇的范圍有關(guān)（本研究患者納入僅限于在醫(yī)院登記就診的患者），應(yīng)擴(kuò)大抽樣范圍及樣本量，盡可能避免選擇偏倚，從而得出更準(zhǔn)確的結(jié)論。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，HIV感染與AIDS患者X線胸片檢查結(jié)果是否異常，患者間CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與本研究納入的患者CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較低有關(guān)［CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)小于10個(gè)／μl的患者占總患者數(shù)的20%，CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)小于100個(gè)／μl的患者占總患者數(shù)的70%（CD4＋T淋巴細(xì)胞分級(jí)無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究分級(jí)是參考的文獻(xiàn)［7－9］）。之所以出現(xiàn)4級(jí)患者數(shù)占總患者數(shù)的70%，是因?yàn)楸狙芯考{入的患者絕大部分來(lái)源于醫(yī)院，正因?yàn)镃D4＋T細(xì)胞較低，所以需要在醫(yī)院接受相應(yīng)的治療。本研究的結(jié)果僅代表在該分級(jí)情況下的研究結(jié)果］。而CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)越低，肺部影像學(xué)征象越不典型［7］。相關(guān)文獻(xiàn)也表明AIDS合并肺結(jié)核患者的影像學(xué)表現(xiàn)復(fù)雜多樣，呈不典型肺結(jié)核改變，特異征象較少［13－15］。提示臨床上對(duì)于HIV感染與AIDS患者，僅僅按照是否具有肺結(jié)核X線胸片的陽(yáng)性癥狀，并不能作為是否合并肺結(jié)核的診斷指征之一，應(yīng)考慮免疫抑制（CD4＋T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)下降有關(guān)）的可能。

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