類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者干擾素調(diào)節(jié)因子4基因表達(dá)變化的研究

尹春香，王曉非

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽 110004）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以侵蝕性滑膜炎為特點的自身免性疾病，其主要臨床特征是對稱性關(guān)節(jié)炎和功能下降。干擾素調(diào)節(jié)因子家族是能對干擾素的基因表達(dá)進行調(diào)控的一類轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控淋巴細(xì)胞分化、平衡過程，參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程，在自身免疫性疾病發(fā)病中起一定作用。目前已知干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferon regulation factor，IRF4）作為干擾素調(diào)節(jié)因子的一種，通過影響淋巴細(xì)胞的分化及干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)控等參與炎癥過程［1］，在自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡［2］等發(fā)病中起重要作用。本文對RA患者外周血IRF4的表達(dá)進行研究，分析其與相關(guān)臨床活動性指標(biāo)的關(guān)系，初步探討IRF4在RA發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

30例患者來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2012年12月住院患者，其中女25例，男5例，年齡26～48歲，平均（36±12）歲，所有患者均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ARA）制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)，排除有嚴(yán)重心腦血管、肝腎疾病和其他自身免疫病。正常對照組28名，其中女22名，男6名，年齡21～54歲，平均（35±6）歲，均為我院體檢的正常人群，均身體健康，無肝、肺、腎臟疾患病史，無心血管系統(tǒng)病史，查體及血生化檢查均無異常。研究組與對照組在性別、年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑：Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）、SYBR green PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增儀ABI9700型（美國ABI公司）。

1.2.2 實驗步驟

1.2.2.1 Trizol法抽提總RNA 安靜狀態(tài)下抽取靜脈全血1 mL，檸檬酸鈉（ACD）抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得白細(xì)胞，按每毫升全血加入1 mL Trizol的比例加人Trizol試劑，使沉淀的白細(xì)胞溶解，依次加入氯仿、異丙醇、乙醇抽提，以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解總RNA，-80℃冰箱低溫保存。

1.2.2.2 使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒 總體積 20 μL，ddH2O：12 μL，mRNA：4 μL，PrimeScript RT Master Mix：4 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃5 s。

1.2.2.3 引物設(shè)計 檢索NCBI數(shù)據(jù)庫查到人類IRF4基因的cDNA全長序列，以甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照基因，設(shè)計擴增板的引物，各引物均由TaKaRa公司合成，IRF4正向引物：5′?GCCCAGCTTGTGAAAATG ?3′，反向引物：5′?CGGC AGTCTGAGAACGC ?3′；GAPDH正向引物：5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC ?3′； 反向引物：5′?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3′。

1.2.2.4 熒光定量PCR反應(yīng) 總體積為20 μL：SYBR混合物10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 5.6 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s（共40個循環(huán)）。

以SDS2.1軟件分析其CT值。CT值反映了模板擴增到一定量拷貝數(shù)時（處于指數(shù)上升期）所需反應(yīng)循環(huán)數(shù)的大小。CT值越大，參與反應(yīng)的起始模板量就越少，反之則越多。計算出標(biāo)化后的-△△CT值。

1.2.3 RF、CCP、CRP、血沉的檢測：由我院檢驗科協(xié)助完成，異常指標(biāo)的判斷均參考同期該項檢查的正常值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17統(tǒng)計分析軟件包統(tǒng)計分析，計量資料均采用±s。各組-△△CT值采用t檢驗，IRF4 mRNA水平與其他血清學(xué)指標(biāo)之間相關(guān)性檢驗采用Pearson相關(guān)分析，以P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

IRF4 mRNA定量表達(dá)：RA患者IRF4 mRNA的表達(dá)（-6.94±0.10）明顯高于正常對照組（-7.62±0.13），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＆lt;0.01）。

IRF4 mRNA水平與RA患者紅細(xì)胞沉降率、CRP、RF、CCP進行相關(guān)性分析RA患者IRF4 mRNA水平與類風(fēng)濕因子（RF）呈正相關(guān)（r=0.726，P＆lt;0.05）、與抗環(huán)瓜氨酸多肽（抗CCP）抗體呈正相關(guān)（r=0629，P＆lt;0.05），與血沉、CRP不相關(guān)（P＆gt;0.05）。

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性滑膜炎為特點的自身免疫性疾病。RA患者由于滑膜的炎癥以及過度的增生致軟骨和骨的進行性破壞，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的殘疾并導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。盡管RA的發(fā)病機制目前還不明確，但隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的進展，RA動物模型的建立，人們發(fā)現(xiàn)RA發(fā)病機制與Th細(xì)胞的亞型及相關(guān)細(xì)胞因子平衡密切相關(guān)，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子平衡可能與RA發(fā)病機制相關(guān)。大量的研究認(rèn)為Thl7細(xì)胞能產(chǎn)生IL?17、IL?21等細(xì)胞因子，功能在于通過這些細(xì)胞因子集體動員、募集及活化中性粒細(xì)胞，從而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。

IL?17是Thl7細(xì)胞產(chǎn)生的最重要效應(yīng)因子，其受體在體內(nèi)廣泛表達(dá)，具有強烈的促炎癥作用。Thl7細(xì)胞的生物學(xué)活性主要通過IL?17來實現(xiàn)。IL?17通過誘導(dǎo)炎性趨化因子的產(chǎn)生刺激炎性細(xì)胞的聚集，通過促進促炎性細(xì)胞因子（TNF?α，IL?6和 IL?1）的產(chǎn)生增強炎性反應(yīng)，通過上調(diào)RANK配體的表達(dá)、誘導(dǎo)一氧化氮的產(chǎn)生和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)介導(dǎo)軟骨的破壞和骨侵蝕［3，4］，在患有RA的鼠和人群中，IL?17的產(chǎn)生增加，且其升高水平與關(guān)節(jié)破壞的嚴(yán)重程度相關(guān)，缺乏IL?17的鼠不會發(fā)生膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎（CIA）［5，6］。IL?21對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理生理有多種作用，是B細(xì)胞應(yīng)答和免疫球蛋白G（IgG）產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)因子［7，8］，在RA患者異常的免疫應(yīng)答中起重要作用，RF和抗CCP抗體之類的自身抗體的表達(dá)最具特征性［9］，阻斷IL?21/IL?21受體途徑能有效改善CIA的病變，去除IL?21的鼠其關(guān)節(jié)炎的進展被完全阻止。

最近的研究表明干擾素調(diào)節(jié)因子4（interferonregulatory factor 4，IRF4）可調(diào)控Thl7分化的基礎(chǔ)性作用。無論是在經(jīng)典的（TNF?β與IL?6）還是替代的（TNF?β與IL?21）Thl7細(xì)胞誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)，IRF4缺陷小鼠的CD4+T細(xì)胞均不能完全分化成Thl7細(xì)胞并產(chǎn)生IL?17。這一缺乏對CD4+T細(xì)胞來說是內(nèi)在的，而不是繼發(fā)于任何發(fā)展變化中。IRF4作為Thl7分化的一個重要控制因子，在體內(nèi)具有重要作用。IRF4不僅是IL?17的早期產(chǎn)生必不可少的，而且也是Thl7細(xì)胞自分泌IL?21絕對需要的。事實上，無論是根據(jù)經(jīng)典的或替代的Thl7細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，IRF4缺乏的CD4T細(xì)胞不能產(chǎn)生IL?2l，從而對Th17細(xì)胞的形成缺少一步關(guān)鍵的放大作用。

本文采用熒光定量PCR方法檢測RA患者外周血IRF4 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血IRF4 mRNA表達(dá)水平比對照組高（P＆lt;0.01），證明其與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，其可能通過調(diào)節(jié)IL?17和IL?21的產(chǎn)生導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

近年研究證明，抗CCP抗體可用于RA的早期診斷，除了診斷性檢驗外，還可能是可用的預(yù)測指標(biāo)，對RA患者長期隨訪發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)抗CCP抗體為發(fā)生侵蝕性關(guān)節(jié)炎的一個危險因素。抗CCP抗體陽性的RA患者更易于發(fā)展為持續(xù)性骨侵蝕性關(guān)節(jié)炎。RF陽性RA患者較RF陰性RA患者有較差的預(yù)后，在關(guān)節(jié)畸形、放射學(xué)侵蝕、關(guān)節(jié)外表現(xiàn)方面RF陽性RA患者中更多見、更嚴(yán)重。本研究顯示IRF4 mRNA表達(dá)水平與類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體水平呈明顯正相關(guān)，提示IRF4 mRNA表達(dá)水平可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨侵蝕程度相關(guān)。

綜上所述，高表達(dá)的IRF4在RA的發(fā)病中起一定作用，且與疾病活動指標(biāo)具有相關(guān)性，但它們之間的相互作用的關(guān)系仍不明確。應(yīng)進一步加大研究IRF4與RA的相關(guān)性，以明確IRF4的作用，期待為RA的預(yù)防、診斷和治療提供幫助。

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