Folin-Ciocalteu比色法測定懷山藥零余子多酚含量的研究

程云環(huán)，滕井通，薛建平，張愛民,盛 瑋

（1.淮北師范大學 化學與材料科學學院；2.淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北 235000）

山藥零余子為薯蕷科多年生藤本植物薯蕷(Dioscorea opposita Thunb.)葉腋間的珠芽[1]，俗稱“山藥蛋”，呈卵圓形或橢圓形，直徑在0.4-2.0cm之間，外表呈淡黃色，頂端中間略有莖痕，質堅硬，斷面灰白色至灰褐色，氣味淡而不苦，口嚼黏膩.主要含有淀粉、多糖、蛋白質、多種游離氨基酸，膽堿、尿囊素、植酸、多種維生素、淀粉酶、山藥素等物質[2].自古就是營養(yǎng)價值很高的滋補食品和藥用價值很好的藥材，但因其體積小、商品價值不高，每年除少量作種用外，大部分都被白白扔掉[3].

多酚是一類廣泛存在于植物體內的多羥基酚類化合物的總稱，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、防曬美白、護肝益腎、抗動脈硬化、防治冠心病與中風等心腦血管疾病以及抑菌消炎抗病毒等多種生理功能[4].論文以懷山藥及其零余子為供試材料，提取多酚物質并進行含量測定、比較分析，為懷山藥零余子進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

懷山藥(Dioscorea opposita Thunb.)及其零余子采集于河南省溫縣，經淮北師范大學生命科學學院薛建平教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬懷山藥及其零余子.將懷山藥及其零余子用流動水沖洗，除去附著在表面的泥沙，然后將懷山藥（切成片狀）和零余子放入電熱鼓風干燥箱中60℃烘干至恒重，將烘干后的懷山藥和零余子粉碎放入干燥器中備用.

1.2 主要儀器

SHH·W21·420三用電熱恒溫水浴鍋 北京東南儀誠實驗室設備有限公司生產；CP213電子分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司生產；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠生產；FDV超微粉碎機 北京環(huán)亞天元機械技術有限公司生產；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司生產；755B紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司生產.

1.3 主要試劑

沒食子酸標準品 生工生物工程（上海）有限公司產品；1N Folin-Ciocalteu試劑（FC試劑） 上海荔達生物科技有限公司產品；無水碳酸鈉、無水乙醇等均為國產分析純.

1.4 沒食子酸標準液的制備

精密稱取干燥至恒重的沒食子酸0.0500g，用超純水溶解并定容至100mL，搖勻，即得標準儲備液.精密量取1.00mL標準儲備液于50mL容量瓶中加超純水定容至50mL，搖勻，即得濃度為10μg·mL-1的沒食子酸標準液，置于冰箱中保存?zhèn)溆?

1.5 懷山藥及其零余子樣品溶液的制備

精密稱取粉碎并干燥至恒重的懷山藥及其零余子樣品各10.0000g，分別裝入圓底燒瓶中，加入體積分數(shù)為80%乙醇200mL，搖勻，在70℃水浴中回流提取2h，真空抽濾，洗滌殘渣2次，合并洗滌液.將乙醇提取液減壓濃縮至無乙醇氣味，用蒸餾水將濃縮物溶解并定容至50mL作為儲備液，從中量取2.00mL用蒸餾水定容至50mL搖勻、備用.

1.6 Folin-Ciocalteu試劑法比色條件的研究

1.6.1 檢測波長的確定

吸取沒食子酸標準溶液，顯色，用紫外可見分光光度計在400～900nm范圍內掃描，選定最大吸收波長為測定波長[5-6].

1.6.2 顯色溫度的選擇

精密吸取1.00mL沒食子酸標準液分別置于10mL試管中，加入FC試劑1.0mL，搖勻，靜置5min，加入質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，搖勻.分別置于15，20，25，30，35℃的水浴鍋中加熱顯色150min，在764nm波長處測定吸光值.

1.6.3 顯色時間的選擇

精密吸取1.00mL沒食子酸標準液分別置于10mL試管中，加入FC試劑1.0mL，搖勻，靜置5min，加入質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，搖勻.將試管放置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色，反應時間分別為60，90，120，150，180min，顯色后于764nm波長處測定吸光值.

1.6.4 Folin-Ciocalteu試劑用量的選擇

精密吸取1.00mL沒食子酸標準液分別置于20mL試管中，加入FC試劑1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，搖勻，靜置5min，分別加入同體積的質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，于764nm波長處測定吸光值.

1.6.5 Folin-Ciocalteu試劑與10%Na2CO3比例的選擇

精密吸取1.00mL沒食子酸標準液分別置于10mL試管中，加入FC試劑1.0mL，搖勻，靜置5min，加入不同體積質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液，使FC試劑與10%Na2CO3溶液體積比分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，置于25℃水浴鍋中加熱顯色150min，于764nm波長處測定吸光值.

1.7 標準曲線的繪制

分別精密吸取0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00mL標準儲備液于25mL容量瓶中加入蒸餾水定容、搖勻.從上述不同濃度的溶液中，移取5.00mL到100mL容量瓶中，分別加入50mL蒸餾水，加入FC試劑2.0mL搖勻，靜置5min，加入質量分數(shù)為10%的Na2CO3溶液2.0mL，用蒸餾水定容，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白作參比，于最大波長處測定吸光值，以沒食子酸質量濃度W（μg·mL-1）為橫坐標，吸光值A為縱坐軸，制作標準曲線[7].

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

2.1.1 檢測波長

掃描圖譜如圖1所示，標準品在400～900nm波長范圍內只有一個單峰，且最大吸收波長為764nm，因此確定764nm為檢測波長.

圖1 標準品紫外掃描圖

2.1.2 顯色溫度的選擇

由圖2可知，隨著溫度升高，吸光值逐漸增大，當溫度到達25℃時，吸光值達到最大值，隨后隨著溫度的升高而降低，因此選擇25℃作為顯色溫度.

圖2 反應溫度與吸光值的關系

2.1.3 顯色時間的選擇

由圖3可知，隨著反應時間的延長，吸光值逐漸增大，當反應時間達到150min后增加不再明顯，曲線變得平坦，因此選擇150min作為顯色時間.

圖3 反應時間與吸光值的關系

2.1.4 Folin-Ciocalteu試劑與10%Na2CO3比例的選擇

由圖4可知，隨著質量分數(shù)為10%的Na2CO3溶液加入量的增加，吸光值逐漸增加，當加入FC試劑與質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液的體積比為1∶1時，吸光值達到最大，因此選擇兩者體積比1∶1作為顯色條件.

圖4 FC試劑與10%Na2CO3試劑比例與吸光值的關系

2.1.5 Folin-Ciocalteu試劑用量的選擇

由圖5可知，相同條件下比色液吸光值隨FC試劑用量的增加先增加，后降低，當FC試劑的用量為2.0mL時吸光值達到最大，因此顯色時FC試劑的用量選擇2.0mL.

圖5 FC試劑用量與吸光值的關系

2.1.6 線性關系

由圖6可見，沒食子酸在濃度為1-6μg·mL-1時，沒食子酸質量濃度與其吸光值呈良好的線性關系，在此范圍內的線性回歸方程為A=0.0966W-0.0054，相關系數(shù)R2=0.9987.

2.2 總多酚含量測定方法的考察

2.2.1 精密度實驗

圖6 沒食子酸標準曲線

精密吸取懷山藥零余子樣品溶液1.00mL置于10mL試管中，平行5份，各加入FC試劑2.0mL，搖勻，靜置5min，加入質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白為參比，于764nm波長處測定吸光值，分別為0.506，0.511，0.513，0.509，0.508，平均值為0.509，其RSD=0.54%（n=5），顯示該方法具有較高的精密度，能滿足樣品分析的要求.

2.2.2 穩(wěn)定性實驗

精密吸取懷山藥零余子樣品溶液1.00mL置于10mL試管中，加入FC試劑2.0mL，搖勻，靜置5min，加入質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，顯色完全后，分別放置0，10，20，30，40min測定吸光值，分別為0.514，0.513，0.510，0.508，0.504，平均值為0.510，RSD=0.79%（n=5），表明實驗穩(wěn)定性良好.

2.2.3 加標回收實驗

精密吸取0.10mL已知懷山藥零余子多酚質量濃度為1.00mg·mL-1的樣品溶液5份，分別精密加入含有40.00，80.00，120.00，160.00，200.00μg沒食子酸對照品溶液，各加入FC試劑2.0mL，搖勻，靜置5min，加入.02mL質量分數(shù)為10%Na2CO3溶液，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白為參比，于764nm波長處測定吸光值，測定結果并計算回收率及RSD，結果見表1.

表1 加標回收實驗結果

2.3 樣品多酚含量的測定

分別精密吸取懷山藥及其零余子樣品溶液1.00mL加入試管中，各加入FC試劑2.00mL，搖勻，靜置5min，加入2.0mL質量分數(shù)為10%的Na2CO3溶液，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白為參比，于764nm波長處測其吸光值，平行測定3次，得懷山藥零余子樣品吸光值分別為0.509，0.510，0.509，平均值為0.509，根據(jù)標準曲線回歸方程計算出懷山藥零余子總多酚含量為0.0666%；懷山藥樣品吸光值分別為0.340，0.336，0.339，平均值為0.338，根據(jù)標準曲線回歸方程計算出懷山藥總多酚含量為0.0447%.

3 結論與討論

實驗以沒食子酸為標準對照品，研究了福林酚試劑法測定多酚的條件，經試驗得出測定波長為764nm，確定了福林酚試劑的最佳用量為2.0mL、福林酚試劑與質量分數(shù)為10%Na2CO3的最佳比例為1︰1、最佳溫度為25℃、反應時間為150min.該測定方法的平均回收率為98.69%，RSD為1.56%，具有較好的精密度.該方法簡便、快速、準確，可用于懷山藥及其零余子實際樣品的測定.

實驗通過對懷山藥及其零余子的多酚含量的測定，結果表明：懷山藥總多酚含量為0.0666%，懷山藥零余子中總多酚含量為0.0447%，懷山藥零余子中總多酚的含量高于懷山藥.

本研究未對懷山藥零余子總多酚及鞣質提取工藝進行優(yōu)化，還需進一步加強研究.

〔1〕趙冰.山藥栽培新技術[M].北京：金盾出版社，1998.193.

〔2〕都恒青.常用中藥材品種整理和質量研究（北方篇）第二冊[M].北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1995.1089.

〔3〕薛建平，祝紅蕾，堯俊英.鐵棍山藥及其零余子營養(yǎng)成分的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2008(8):268-269.

〔4〕馮麗,宋曙輝,趙霖,等.植物多酚種類及其生理功能的研究進展[J].江西農業(yè)學報，2007,19(10):105～107.

〔5〕王岸娜,徐山寶,劉小炎,等.福林法測定獼猴桃多酚含量的研究[J].食品科學,2008（29）:398～401.

〔6〕韓菊,魏福祥.Folin-Ciocalteu 比色法測定蘋果渣中的多酚[J].食品科學,2010（31）:179～182.

〔7〕吳亮亮,石雪萍,張衛(wèi)明.Folin-Ciocalteu 比色法測定花椒中多酚含量的研究[J].中國野生植物資源,2010（12）:54～56.