雜食性魚類排泄物中藻類光能活性研究

王銀平,趙 勇*,曾慶飛,孫明波

(1.河南農業(yè)大學林學院,河南 鄭州 450002；2.中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室,江蘇 南京 210008；3.中國科學院大學,北京 100049)

非經典生物操縱理論指出,通過放養(yǎng)濾食性魚類直接牧食水華藍藻,可以達到控制藍藻生產力、消除藍藻水華的目的[1].在藍藻水華爆發(fā)期間,鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)腸含物中 90%以上為微囊藻[2].劉建康等認為鰱、鳙的直接攝食作用是東湖藍藻水華 15a銷聲匿跡的主要原因[1].Moriarty[3]認為羅非魚能徹底消化吸收微囊藻.但利用非經典生物操縱來控制藍藻水華至今尚存分歧,主要集中在可能引起水體浮游生物個體小型化和微型藻類生物量的激增[4-6].

1987年,Kharitonova等[7]發(fā)現(xiàn)鳙消化后的微囊藻在特定的培養(yǎng)基上可以生長.Datta等[8]將從白鰱和鳙魚排泄物中提取出的微囊藻在過濾的湖水中培養(yǎng)若干天后,其生物量急劇增加.Kolmakov等[9]測定了鯽魚排泄物中活性藻類的物種組成、生物量及藻光合效率變化,發(fā)現(xiàn)微囊藻的生長與光合活性都顯著的增強.Miura等[10]通過開展鳙魚控藻研究實驗指出,鳙魚排泄物中的活性微囊藻經過培養(yǎng)后光合活性是相同條件下未被攝食藻的2倍. Lewin等[11]指出某些微囊藻表面具黏液覆蓋層,在穿過魚類腸道時起保護作用,其利用32P標記的活體和死亡微囊藻飼喂擬鯉(Rutilus rutilus),發(fā)現(xiàn)排泄物中活體微囊藻的32P放射活性顯著高于死亡微囊藻,證明了微囊藻非但不能被擬鯉消化吸收,反而還能利用腸道消化物中的磷.可見,食藻魚類排泄物中具有光合活性的微囊藻很有可能對系統(tǒng)小型藻類的激增做出直接的貢獻,而目前這方面的研究還較少.

植物葉綠素熒光動力學技術能夠快速靈敏、無損傷地反映PSII的狀況以及植物對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等潛在特點,是研究植物光合生理方法及植物與逆境脅迫關系的理想探針[12].目前國內尚未見有關利用葉綠素熒光技術研究魚類攝食對藻類生長及葉綠素熒光活性變化的報道.鯽魚和金鯽魚屬于雜食性魚類,且有報道指出,在自然水體中鯽魚腸道內發(fā)現(xiàn)微囊藻.本研究借助藻類葉綠素熒光技術,研究微囊藻被鯽魚、金鯽魚攝食后,其葉綠素熒光活性、葉綠素含量及細胞密度的變化,以此來探討雜食性類控藻的生態(tài)后效和長效管理理論,以期為生物控藻機理的探究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與設計

實驗鯽魚(體重：165.8±2.0g,體長：22.4±1.1cm)和金鯽魚(體重：33.7±1.2g,體長：13.7±0.4cm)分別購于南京眾彩水產品市場和夫子廟花鳥蟲魚市場,體表無傷,體質健壯,相同品種規(guī)格大小一致：藍藻取自太湖梅梁灣,經顯微鏡觀察,99%為微囊藻(Microcystisspp.),實驗前將濃縮的微囊藻懸浮液超聲擊散成小群體;藻類培養(yǎng)液取自太湖梅梁灣,經Whatman GF/C預濾.

實驗開始前,鯽魚和金鯽魚分別暫養(yǎng)在3個水族箱(尺寸：60cm(長)×40cm(寬)×50cm(高),水面高度距上端15cm)2星期以適應環(huán)境,每箱鯽魚5尾,金鯽魚8尾,全天曝氣,恒定室溫25℃,暫養(yǎng)期間每天 09：00點飼喂顆粒魚飼料,投放量以正巧攝食為宜,15：00點添加少量藍藻懸浮液馴化魚類攝食.實驗開始前,將實驗魚種饑餓48h以排空腸道內含物.向各水族箱添加 1L混合均勻的濃藍藻懸浮液,連續(xù)48h收集魚類排泄物.將收集到的排泄物振蕩分散均勻后,分別對應等體積(50mL)添加到含1000mL過濾湖水的三角燒瓶中,于同一時間取相同體積未被攝食的藍藻懸浮液為對照,使各組初始Chl a濃度相同,每組3個平行放入光照培養(yǎng)箱,每天定時搖動 4次,培養(yǎng)周期為 9d.光照培養(yǎng)溫度為25℃,光照 4000lx,光暗比為 12h：12h.

1.2 葉綠素熒光參數(shù)的測定

葉綠素熒光參數(shù)的測定利用德國Walz公司生產的雙通道 PAM-100熒光儀按照梁英等[13]的方法進行.暗適應 15～20min后測量,進行淬滅分析,取達到穩(wěn)定后的熒光值進行統(tǒng)計分析.

葉綠素熒光的主要參數(shù)包括：基礎熒光Fo,最大熒光Fm,可變熒光Fv,光下基礎熒光Fo′,光下最大熒光Fm′,光下可變熒光Fv′,最大光能轉化效率Fv/Fm,PSII的潛在活性(Fv/Fo),實際光能轉化效率(ΦPSII),光合電子傳遞速率(ETR),光化學淬滅(qP),非光化學淬滅(NPQ).

1.3 葉綠素含量與細胞密度測定

葉綠素經熱乙醇法[14]提取后,利用紫外分光光度計比色測定后計算得出.

前期培養(yǎng)階段,將藻群體用超聲波擊散均勻后稀釋成不同梯度,分別測定各梯度藻液在680nm處的吸光度(A680),同時采用流式細胞儀測出各梯度相應的細胞密度,即可得到細胞密度(C,個/mL)和A680之間的線性關系：C=A×A680+B.實驗期間,自接種之日起,每天同一時間取樣,同樣方法測定吸光度.

1.4 數(shù)據(jù)處理文中的方差及相關性分析采用SPSS Statistics 17.0軟件進行.

2 結果與分析

由圖1可見,實驗周期內,鯽魚、金鯽魚組微囊藻的葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP、NPQ)、Chl a濃度及細胞密度均低于對照組.鯽魚組微囊藻葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSII、ETR初始值與對照組相比分別降低了 34.12%、15.94%、8.78%、18.44%,qP、NPQ卻升高了16.73%、6.25%;金鯽魚組微囊藻葉綠素熒光參數(shù)初始值相比對照組變化更為明顯,Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSII、ETR、NPQ 分別比對照降低 45.05%、24.06%、9.64%、37.99%、85.79%,qP增加了18.97%.

魚類排泄物培養(yǎng)期間,實驗組與對照組葉綠素熒光參數(shù)在前3d均下降,兩實驗組下降較對照組明顯;從實驗第3d開始,對照組微囊藻葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fo、Fv/Fm、ETR、qP緩慢增加,而鯽魚組相關參數(shù)值(除ETR、qP外)上升明顯,qP從第2d開始上升,到第4d時達到一個極大值,接著直線下降;金鯽魚組的葉綠素熒光參數(shù)值(除 NPQ外)一直呈下降趨勢.培養(yǎng)結束時,鯽魚組微囊藻葉綠素熒光參數(shù)(ΦPSII、ETR)達到與對照組相當水平,僅Fv/Fm、qP略高于對照組.鯽魚組微囊藻NPQ初始值高于對照組,而金鯽魚組微囊藻NPQ遠低于對照組,實驗期間各組微囊藻的NPQ滅均波動明顯,實驗前期金鯽魚組微囊藻NPQ急劇上升,第4d時NPQ為對照組的2.5倍,同時也明顯高于鯽魚組,第5d開始下降,直到實驗結束時下降到最小值,此時極顯著低于對照組(P＜0.01).實驗期間,對照組微囊藻Chl a濃度在300～350μg/L之間波動,實驗組初始Chl a濃度相比對照組均略有減少,鯽魚組和金鯽魚組分別降低了 9.17%和11.52%;鯽魚組的Chl a濃度在實驗第3d后逐漸上升,而金鯽魚組的 Chl a濃度一直下降.培養(yǎng)期間微囊藻細胞密度變化趨勢與Chl a濃度相同,金鯽魚組的微囊藻細胞密度顯著(P＜0.05)低于其他組.

表1 不同組Chl a濃度及細胞密度與葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP、NPQ)相關分析Table 1 Correlation coefficient of chlorophyll content and cell density with chlorophyll-a fluorescence parameters in different groups

相關性分析結果(表 1)顯示,實驗期間,對照組Chl a濃度與葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fo、NPQ呈極顯著正相關(P＜0.01),細胞密度與葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fo、Fv/Fm、ETR呈顯著正相關(P＜0.05),而qP與Chl a濃度和細胞密度無顯著負相關關系.鯽魚組微囊藻Chla濃度、細胞密度與葉綠素熒光參數(shù)均呈正相關關系,Chl a濃度與Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSII呈極顯著正相關(P＜0.01),與 ETR呈顯著正相關(P＜0.05),細胞密度與Chl a濃度不同,其僅與 ΦPSII相關關系達到極顯著水平(P＜0.01),與Fv/Fm、ETR 呈顯著正相關關系(P＜0.05).金魚組微囊藻Chl a濃度、細胞密度與葉綠素熒光參數(shù)(除 NPQ未達到顯著水平外)均呈極顯著正相關關系(P＜0.01).

圖1 不同魚攝食對微囊藻葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP、NPQ),Chl a含量及細胞密度的影響Fig.1 Chlorophyll fluorescence parameters、concentration of chlorophyll a (Chl,μg/L)and cell density in water samples,inoculated with intestine contents of Crucian Carp、Gold Crucian Carp and with phytoplankton from Taihu Lake

3 討論

迄今為止,國內外關于魚類控藻效果的報道,主要集中在魚類攝食對生態(tài)系統(tǒng)浮游生物群落結構的影響[15-16]、魚類的消化吸收效率和物質利用途徑[17]等方面,而以魚控藻排泄物為研究對象的研究公開報道較少[18].藻細胞葉綠素熒光特性與光合作用中各種反應密切相關,可以通過對體內葉綠素熒光參數(shù)的測定反映多種逆境因子對藻類光合作用的影響,因此被視為藻類光合作用與環(huán)境關系的內在探針,因此葉綠素熒光分析技術常用于檢測植物光合機構適應環(huán)境脅迫的能力[19].Fv/Fm為光系統(tǒng) II(Photosystem II,簡稱PSII)的最大光化學量子產量,反映PSII反應中心的內稟光能轉換效率或稱PSII的最大光能轉化效率.在非脅迫條件下此參數(shù)變化很小,但在脅迫條件下變化較大,因此它是反映微藻生長狀況的重要參數(shù).Fv/Fo反應 PSII的潛在活性.ΦPSII反映PSII在脅迫中反應中心部分關閉狀況時實際原初光能捕獲效率,可反映實際的 PSII反應中心進行光化學反應的效率.ETR表示PSII的表觀電子傳遞速率.qP反映PSII天線色素吸收的光能用于光合作用的份額,它一定程度的反映了 PSII的開放情況.NPQ反映的是PSII天線色素吸收,但不能用于光合電子傳遞而以熱能耗散的光能部分.當 PSII反應中心天線色素吸收過多光能時,如不能及時地耗散掉將對光合機構造成損傷或破壞,因此非光化學淬滅是一種自我保護機制,對光合機構起一定的保護作用.本研究主要借助葉綠素熒光成像系統(tǒng),以雜食性魚類鯽魚和金鯽魚攝食藍藻后的排泄物為研究對象,探討未消化藻類的生長和光能活性,從而為魚控藻排泄物對微型藻類增殖的貢獻提供參考.

本研究中,鯽魚組葉綠素熒光參數(shù)從培養(yǎng)第3d開始逐漸上升,金鯽魚組則一直呈現(xiàn)下降趨勢.可見,微囊藻被鯽魚攝食后經過短時間適應性調節(jié),PSII的潛在活性開始得到有限的恢復,而金鯽魚攝食后微囊藻受到不可逆的傷害.Fv/Fm反應PSII反應中心利用所捕獲激發(fā)能的情況,鯽魚組微囊藻經過短時間的適應性調節(jié)后,PSII開放的反應中心比例增加,并且隨著時間的延長,光合電子鏈的傳遞速率的到一定程度的恢復,從而維持正常的暗反應,而金鯽魚組微囊藻暗反應無法正常進行;金鯽魚組微囊藻NPQ明顯升高,說明微囊藻細胞受到傷害后自我保護機制加強.

鯽魚攝食后微囊藻的葉綠素熒光參數(shù)初始值降低,但仍能正常進行光合作用,并且光合活性在一周內就得到恢復,而葉綠素含量與細胞密度的變化趨勢也類似,但開始恢復的時間不同.Miura等[10]研究指出鳙魚攝食藍藻后,排泄物中活性藍藻葉綠素含量與光合活性加倍增強;Kolmakov等[9]在西伯利亞一個小型水庫開展鯽魚控藻實驗后指出,微囊藻生長受到刺激,并且生長速度與潛在光合活性明顯高于原藻.本次研究中,鯽魚組微囊藻葉綠素熒光參數(shù)、Chla濃度及細胞密度在實驗初期短暫降低后立即恢復,至實驗結束時,生長與光合活性水平與對照組相當.經過鯽魚腸道后微囊藻生長與光合活性能短時間內得到恢復,說明鯽魚的攝食沒有對微囊藻造成致命的傷害;微囊藻被鯽魚攝食后依然具有活性,可能原因有：(1)藻群體被鯽魚攝食破壞后機械重組為小型群體[9],但是大多數(shù)微囊藻細胞沒被破壞,在環(huán)境條件相同的情況下,小型微囊藻群體經過短暫調整后,恢復到原有生長狀態(tài).(2)鯽魚僅僅刮食附在藻群體表面的細菌[20];鯽魚的濾食沒有對微囊藻細胞造成生理上的致命傷害,僅將微囊藻群體表面附著的共生細菌去除,藻群體變小,原有生境變化.經過一定時間的適應性調整,微囊藻最終恢復到原有的生長狀態(tài).模擬實驗表明在富營養(yǎng)化水體環(huán)境條件下,魚腸道內的環(huán)境對排泄物中活性微囊藻的后期生長起著非常關鍵作用[9],但目前還不能準確知道濾食魚類如何影響藻的生長,一種觀點是微囊藻吸收了魚腸道內含量相對較高的生命必需元素[11](主要是磷)而生長受到刺激,但是在藍藻爆發(fā)的富營養(yǎng)化湖泊,這種生命必需元素含量已經很高[9].因此,這種影響肯定具有種屬特異性,即某些藻被鯽魚攝食后能夠徹底消化或者生長受到抑制,而另一些特定的藻種在經過鯽魚腸道時不會被消化,相反其生長會受到刺激[21].

金鯽魚攝食后微囊藻葉綠素熒光參數(shù)(除NPQ外)、Chla濃度、細胞密度明顯降低,至實驗結束時,金鯽魚組微囊藻的各測定值遠低于對照組,葉綠素熒光參數(shù)值接近零,說明金鯽魚能夠有效的控制微囊藻的生長.金鯽魚攝食組各測定值急劇降低,可能由于魚類胃液 pH值較低,Moriarty[3]的研究顯示微囊藻被羅非魚攝食后藻細胞消亡是由于該魚種的胃液 pH值低,因此能夠較好的溶解藻細胞壁,從而易于消化微囊藻,這樣對控制藍藻水華起到極大作用.但是金鯽魚屬于無胃魚類,因此不會和羅非魚一樣具有極低pH值的胃液而有助于破壞微囊藻的黏液外殼,從而提高消化吸收率.金鯽魚是如何有效的控制微囊藻的生長,有待更進一步深入的研究,但是金鯽魚作為一種觀賞魚類,不適宜在大面積水體放養(yǎng),并且還有可能會刺激其他種藻的生長.因此,從各方面綜合考慮,利用鯽魚或者金鯽魚作為生物操縱工具來控制藍藻爆發(fā),必須基于該水體優(yōu)勢藻與其他藻及環(huán)境因子的相互關系.

4 結論

4.1 實驗周期內,鯽魚、金鯽魚組微囊藻的葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSII、ETR、qP、NPQ)、Chl a濃度及細胞密度均低于對照組.

4.2 魚類排泄物培養(yǎng)期間,實驗組與對照組葉綠素熒光參數(shù)在前3d均下降,兩實驗組下降較對照組明顯.4.3 相關性分析結果(表1)顯示,實驗期間,對照組Chl a濃度與葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fo、NPQ呈極顯著正相關(P＜0.01),細胞密度與葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fo、Fv/Fm、ETR 呈顯著正相關(P＜0.05),而 qP與Chl a濃度和細胞密度無顯著負相關關系.

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