CDX2基因高表達對胃癌細胞生物學行為的影響

秦 蓉 儲 婧 陳宗科 陳曉雙 王娜娜

（安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理教研室，合肥230032）

胃癌是源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率居我國惡性腫瘤首位，近年來，大量研究已證實胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預后是多基因改變的結果。尾側型同源轉(zhuǎn)錄因子－2（caudal type homeobox transcription factor－2，CDX2）是人體中腸道特異性表達的核轉(zhuǎn)錄因子，在腸黏膜上皮細胞的發(fā)育及保持其形態(tài)、結構特征中起著重要作用［1］。CDX2蛋白在正常胃黏膜中無表達，在絕大多數(shù)胃黏膜腸化生中呈陽性表達［2，3］，提示 CDX2蛋白在胃黏膜細胞中的異常表達是發(fā)生胃黏膜腸化生的重要起始事件。CDX2在從腸化生到胃癌的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用［4］，被認為是與腸型胃癌發(fā)生密切相關的關鍵調(diào)節(jié)因子。本課題的前期研究表明CDX2的表達與胃癌分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者預后密切相關［5］。為了進一步明確CDX2基因在胃癌中的作用，本研究通過建立穩(wěn)定過表達CDX2基因的胃癌細胞株，應用分子克隆、RT－PCR、Western blot、MTT、流式細胞等分子生物學技術，在體外實驗中研究CDX2過表達對胃癌細胞生物學行為的影響，試圖揭示CDX2基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，從而為CDX2的基因治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1．主要試劑

DMEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰酶購自碧云天生物技術公司，質(zhì)粒小量抽提試劑盒、高保真擴增酶、Trizol RNA抽提試劑購自美國Invitrogen公司，Attractene Transfection Reagent購自德國 QIAGEN 公司，MTT購自Sigma公司，兔抗人CDX2抗體購自Signalway antibody（SAB）公司，S－P免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，ECL＋plus試劑盒購自Amersham公司，PI染色試劑盒為南京凱基公司產(chǎn)品。

2．細胞株和質(zhì)粒

人胃癌細胞株BGC－823細胞株為本實驗室保存，用10%的小牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃，5%的CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。pcDNA4／TO／Myc－HisA－CDX2載體質(zhì)粒由日本廣島大學細胞生物學研究部Dr．Shuho Semba饋贈。

3．CDX2重組真核表達質(zhì)粒的鑒定、擴增和提取

將重組真核表達質(zhì)粒pEGFP－C1經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切鑒定正確，并經(jīng)測序與GenBank中的序列完全一致，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，涂板，挑選單克隆后擴增。采用Invitrogen公司的質(zhì)粒小提試劑盒從大腸桿菌中抽提質(zhì)粒，操作方法詳見說明書，用紫外分光光度儀測定OD260／280比值來計算DNA的濃度及純度，－20℃保存。

4．瞬時轉(zhuǎn)染及鑒定

BGC－823人胃癌細胞株常規(guī)培養(yǎng)，按1×106／孔接種在6孔板中，待細胞達到80%融合后，在細胞生長狀態(tài)良好的情況下進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按QIAGEN公司 Attractene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行，實驗分組：①陰性對照組：只接種細胞，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；②空載體對照組：轉(zhuǎn)染pEGFPC1；③實驗組：轉(zhuǎn)染pEGFP－C1－CDX2。熒光倒置顯微鏡下觀察載體中增強型綠色熒光蛋白的表達，判斷轉(zhuǎn)染效率。

5．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及篩選

選取生長狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的BGC－823細胞，胰酶消化，重懸，以2×105／孔的密度接種于6孔板中，等待細胞鋪滿孔70%－80%時，使用Attractene Transfection Reagent轉(zhuǎn) 染 試 劑 介 導pEGFP－C1－CDX2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BGC－823細胞。待轉(zhuǎn)染24h后，按照1∶4的比例傳代，接種于24孔板中，細胞貼壁以后加入含有400μg／ml G418的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)8h后，以200μg／ml G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至篩選出克?。ù蠹s20－25d）。挑選出克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定細胞株，將其命名為BGC－823／CDX2。以轉(zhuǎn)染空載體pEGFP－C1及未轉(zhuǎn)染組為對照。

6．轉(zhuǎn)基因細胞中目的基因表達鑒定

①半定量RT－PCR：從轉(zhuǎn)基因細胞中提取總RNA，經(jīng) M－MLV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取3μl cDNA進行PCR擴增，按常規(guī)操作進行。②Western blot檢測：收集轉(zhuǎn)基因細胞，經(jīng)蛋白裂解液提取蛋白，BCA法進行定量。分別取30μg蛋白經(jīng)SDSPAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以50g／l脫脂奶粉室溫封閉2h。TBST漂洗3次（5－10min／次），加入兔抗CDX2抗體（1∶200稀釋）室溫孵育2h。TBST漂洗同前，辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG（1∶400稀釋）室溫孵育1h，TBST漂洗同前，DAB顯色，分析條帶灰度值及蛋白含量。③免疫細胞化學檢測：將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組、空載體組和未轉(zhuǎn)染組BGC－823細胞常規(guī)消化，進行細胞爬片，同時以PBS代替一抗作空白對照，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，血清封閉，滴加一抗（兔抗人CDX2多克隆抗體，濃度為1∶100），PBS沖洗后滴加HRP標記的二抗，DAB顯色5 min，蘇木素復染細胞核，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并照相。

7．細胞生長曲線測定（MTT法）

分別將1×104BGC－823／CDX2組、空載體組和未轉(zhuǎn)染組細胞置于96孔板中，細胞生長過夜后，取20μl MTT 溶液 （5mg／ml）加入96 孔板中，37℃ 繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，加入200μl DMSO充分溶解細胞內(nèi)結晶，采用酶標儀測定A490nm值，連續(xù)7d，繪制生長曲線。

8．流式細胞儀法檢測

CDX2基因轉(zhuǎn)染對BGC－823細胞凋亡的影響根據(jù)Annexin－FITC／PI雙標記試劑盒說明操作。每個樣本收集20000個細胞熒光信號。

9．細胞劃痕實驗

取生長良好的三組細胞，消化至六孔板中，貼壁后對細胞進行劃痕，每孔劃一次，寬度和長度在lmm×20mm左右，每組設3個復孔，每孔選取5段觀測。用無血清DMEM培養(yǎng)基輕輕吹打劃痕附近，吸去培養(yǎng)基，反復3次，將刮掉的細胞沖洗干凈。拍照，并標記0h的拍照位點。每孔加入適量含10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24h、48h拍照記錄，觀察每組細胞的遷移程度。

10．基因芯片技術檢測

采用 Affymetrix Human Genome U133Plus 2．0Array基因芯片，及其試劑盒所建議的檢測方法。依據(jù)檢測結果和Affymetrix所建議的方法，iterPlier計算核心基因表達讀數(shù)計算值（芯片讀數(shù)計算值）。以上RNA質(zhì)量和芯片檢測委托先進通量（上海）生物技術有限公司（Advanced Throughput Inc．（SH））完成。

11．統(tǒng)計學分析

用SPSS13．0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，多樣本組間比較用方差分析，兩兩比較采用SNK法，即q檢驗。檢驗水準α＝0．05，P＜0．05，差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．重組真核表達質(zhì)粒pEGFP－C1－CDX2雙酶切鑒定結果

pEGFP－C1－CDX2質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后得到約5kb的pEGFP－C1載體條帶和1kb的CDX2目的基因條帶（圖1）。

圖1 陽性克隆雙酶切鑒定。Fig．1Electrophoresis of EcoRI and BamHI restriction enzymed for positive clone．

2．CDX2基因轉(zhuǎn)染BGC－823細胞鑒定

pEGFP－C1－CDX2載體上帶有報告基因增強型綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染48h后在熒光倒置顯微鏡下觀察，CDX2基因成功瞬時轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株BGC－823，轉(zhuǎn)染效率50%左右（圖2）。

圖3 RT－PCR檢測人胃癌BGC－823細胞CDX2mRNA表達。1．BGC－823空白細胞組 2．BGC－823／EV組 3．BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組圖4 Western blot檢測人胃癌BGC－823細胞CDX2蛋白表達。1．BGC－823空白細胞組2．BGC－823／EV組3．BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組Fig．3The expression levels of CDX2mRNA and protein in human gastric carcinoma BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2were detected by RT－PCR．1：BGC－823group，BGC－823cells transfected without plasmid；2：BGC／EV group，BGC－823cells transfected with empty vector pEGFP－C1；3：BGC－823／CDX2group，BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2．Fig．4The expression levels of CDX2protein in human gastric carcinoma BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2were detected by Western blotting．1．BGC－823group，BGC－823cells transfected without plasmid；2．BGC－823／EV group，BGC－823cells transfected with empty vector pEGFP－C1；3．BGC－823／CDX2group，BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2．

3．CDX2基因表達的鑒定

①半定量RT－PCR檢測：與對照細胞相比，BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組細胞中CDX2的mRNA水平明顯升高。經(jīng)特異性引物擴增在961bp處出現(xiàn)單一條帶，表明CDX2基因已被成功導入細胞，篩選正確（圖3）。②Western blot分析：經(jīng) Western blot檢測，CDX2蛋白在BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組細胞中出現(xiàn)明顯條帶，與CDX2蛋白分子質(zhì)量一致，表明CDX2基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入靶細胞，蛋白呈高表達，而對照細胞呈極微量表達（圖4）。③免疫細胞化學檢測：用CDX2特異抗體檢測BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組細胞蛋白的表達，結果顯示：BGC－823轉(zhuǎn)染組細胞呈棕褐色，說明CDX2蛋白在該細胞中呈高表達，主要表達于細胞核內(nèi)，胞質(zhì)中呈散在分布（圖5）。

圖2 檢測pEGFP－C1－CDX2轉(zhuǎn)染人胃癌BGC－823細胞的轉(zhuǎn)染效率。A．倒置顯微鏡下觀察BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組（×200）；B．熒光顯微鏡下觀察BGC－823／CDX轉(zhuǎn)染組（×200）Fig．2Efficiency of transient pEGFP－C1－CDX2transfection into human gastric carcinoma BGC－823cells．A．BGC－823／CDX2group，BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2，observed under an inverted－phase contrast microscope，×200．B．BGC－823／CDX2group，BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2，observed under an inverted fluorescence microscope，×200．

圖5 細胞免疫組化檢測人胃癌BGC－823細胞CDX2蛋白表達。A．BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組（×400）；B．BGC－823空白細胞組（×400）Fig．5The expression levels of CDX2protein in human gastric carcinoma BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2were detected by immunohistochemistry．A．BGC－823／CDX2group，BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2（×400）；B．BGC－823group，BGC－823cells transfected without plasmid（×400）．

4．細胞生長曲線測定（MTT法）結果

應用MTT顯色法檢測轉(zhuǎn)基因前后BGC－823細胞生長情況，繪制生長曲線（圖6），與對照細胞相比，BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯降低，第3d差異最明顯。

圖6 MTT法檢測CDX2基因過表達對人胃癌BGC－823細胞體外增殖能力的影響Fig．6The effect of overexpression of CDX2gene on proliferation of human gastric carcinoma BGC－823cells was detected by MTT method．BGC－823／CDX2group：BGC－823 cells transfected with recombinant expression vector pEGFPC1－CDX2；BGC－823／EV group：BGC－823cells transfected with empty vector pEGFP－C1；BGC－823group：BGC－823 cells transfected without plasmid．There was no significant difference in proliferation between BGC－823／EV group and BGC－823group．The proliferation ability of BGC－823／CDX2 group was significantly inhibited．＊P＜0．05，vs the BGC－823／EV group and BGC－823group（n＝3）．

5．流式細胞儀檢測細胞凋亡（圖7）

凋亡標記物Annexin－V和propidium iodide染色顯示（包括早期凋亡和晚期凋亡）相比較于BGC－823／EV組，BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組在凋亡率上差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0．05），值得注意的是，相比較于空白細胞組，BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組細胞可見早晚期凋亡增加，亦發(fā)現(xiàn)少量細胞死亡，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。?

圖7 流式細胞術檢測CDX2過表達對人胃癌BGC－823細胞凋亡的影響。A．空白細胞組BGC－823；B．BGC－823／EV組；C．BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組Fig．7The effect of over－expression of CDX2gene on apoptosis of human gastric carcinoma BGC－823cells was detected by flow cytometry．A．BGC－823group，BGC－823cells transfected without plasmid；B．BGC－823／EV group，BGC－823cells transfected with empty vector pEGFP－C1；C．BGC－823／CDX2group，BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFP－C1－CDX2．

轉(zhuǎn)染CDX2基因?qū)GC－823細胞遷移能力的影響細胞劃痕實驗顯示，劃痕0h時細胞貼壁良好，劃痕完全，劃痕處無細胞貼壁或懸??；劃痕24h后，與BGC－823空白細胞組和 BGC－823／EV 組相比，BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組的愈合速度明顯減慢；48h時，BGC－823空白細胞組和 BGC－823／EV 組的細胞已基本愈合，而BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組仍然存在間隙。3次重復實驗均表明BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組的細胞遷移能力（遷移細胞計數(shù)）在劃痕48h后明顯低于空白細胞組和 BGC－823／EV 組（P＜0．05，圖8）。說明CDX2高表達抑制了BGC－823細胞運動遷移的能力。

圖8 CDX2基因過表達對人胃癌BGC－823細胞體外遷移能力的影響。8A、8D、8G．空白細胞組BGC－823；8B、8E、8H．BGC－823／EV 組；8C、8F、8I．BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組；8A、8B、8C．0h 倒置顯微鏡下觀察；8D、8E、8F．24h倒置顯微鏡下觀察；8G、8H、8I．48h倒置顯微鏡下觀察Fig．8The effects of CDX2gene over－expression on migration of human gastric cancarcinoma BGC－823cells were detected by scratch wound healing （observed under an inverted－phase contrast microscope，×100）assays．8A，8D，8G．BGC－823 group，BGC－823cells transfected without plasmid；8B，8E，8H．BGC－823／EV group，BGC－823cells transfected with empty vector pEGFP－C1；8C，8F，8I．BGC－823／CDX2group，BGC－823cells transfected with recombinant expression vector pEGFPC1－CDX2；＊＊P＜0．05，vs the control group and the blank group（n＝3）．7A，7B，7C．observed under an inverted－phase contrast microscope at 0hour，×100；8D，8E，8F．observed under an inverted－phase contrast microscope at 24hour，×100；8G，8H，8I．observed under an inverted－phase contrast microscope at 48hour，×100．

7．腫瘤相關基因表達的基因芯片分析

基因芯片分析發(fā)現(xiàn)了兩組細胞BGC－823／EV和BGC－823／CDX2間的差異表達基因（以表達差異≥2．0或≤0．5倍為限）共478條，其中上調(diào)基因215條，如 GATA－6、RUNX－3、CLDN－7、CLDN－1、SPON2、ERBB3等；下調(diào)基因263條，如 DKK3、FOXP1、GATA3、SOX7、THY1、TWIST1、CD24等。經(jīng)過分析，這些差異基因與細胞的增生、分化、侵襲轉(zhuǎn)移和細胞信號轉(zhuǎn)導密切相關。

討 論

CDX2錄屬于尾相關性同源盒基因家族，屬于腸特異性的轉(zhuǎn)錄因子，最早CDX2基因及其相關蛋白在果蠅中分離成功，發(fā)現(xiàn)與parahox家族是呈高度同源性［6］。近年來人體染色體的研究表明，CDX2基因的全長22－23kb，位于染色體的13q12－13，是由3個外顯子和2個內(nèi)合子組成，而與之相對應的CDX2蛋白包含有311個單氨基酸，其通過螺旋－環(huán)－螺旋的方式結合于DNA的相應區(qū)域，以轉(zhuǎn)錄因子的形式調(diào)節(jié)著DNA的表達［7］。CDX2在人體組織細胞中正常只是表達于腸上皮、胰腺導管以及腺泡上皮內(nèi)，而在食管以及胃上皮中是不表達的［8］。

本研究中克隆并構建了特異性真核表達載體pEGFP－C1－CDX2，經(jīng)雙酶切鑒定和測序證實后，采用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染至CDX2低表達胃癌細胞株BGC－823，經(jīng)G418篩選得到抗性細胞克隆，并進一步擴大培養(yǎng)。經(jīng)RT－PCR檢測顯示，與對照細胞相比較，BGC－823／CDX2轉(zhuǎn)染組細胞中CDX2基因在mRNA水平上的表達明顯上調(diào)；Western blot和免疫細胞化學檢測均顯示，轉(zhuǎn)染組細胞中CDX2蛋白的表達明顯增高，表明pEGFP－C1－CDX2重組載體已轉(zhuǎn)入BGC－823細胞，從而成功地建立了CDX2基因的高表達體系。

該課題通過MTT細胞增殖實驗的研究，結果發(fā)現(xiàn)：相比較于空白細胞組和空載體組的胃癌細胞，將CDX2導入胃癌細胞BGC－823中后，胃癌細胞的生長受到了較為明顯的抑制。Mallo GV等［9］研究了人結腸癌細胞HT－29和Caco－2，發(fā)現(xiàn)這兩種細胞系中的CDX2的高表達導致了細胞生長率相對于對照組相比下降。CDX2抑制HT－29細胞增殖的機制可能是通過誘導細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑CDK1p21／WAFI／CIP的表達［10］。最近也同樣有研究報道證實CDX2可以誘導大鼠IEC－6細胞中的肝磷脂結合表皮生長因子樣生長因子（heparinbinding EGF－like growth factor）的表達，并且抑制IEC－6細胞的增殖。在胰腺癌中，已有很多研究報告指出Cyclin D1作為一個關鍵性的基因參與胰腺癌細胞的增殖和分化［11］，CDX2通過結合核因子NF－κB的結合位點來抑制Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制胰腺癌細胞的增殖。

該研究中還發(fā)現(xiàn)相對于空白細胞組和空載體組細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組胃癌細胞的遷移能力明顯減弱，本課題組在體內(nèi)研究也曾發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CDX2的表達與淋巴結轉(zhuǎn)移負相關。同源盒基因的表達改變將導致細胞遷移和轉(zhuǎn)移的變化，這一結論已經(jīng)在多種腫瘤類型 中 有 相 關 的 報 道［12－14］。Hegde等［15］究 證實CDX2的缺失增加了人結直腸癌細胞的遷移，并引起上皮細胞的上皮間葉轉(zhuǎn)變（epithelial to mesenchymal transition，EMT），從而使癌細胞的運動能力明顯增長。有學者證實在結腸癌細胞中導入外源性CDX2基因后，能夠明顯抑制結腸癌細胞的侵襲能力，這些實驗數(shù)據(jù)都證實了CDX2的表達在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移上扮演一定的角色。

該課題利用流式細胞儀檢測CDX2對胃癌細胞凋亡的影響時發(fā)現(xiàn)，相比較于空白細胞組和空載體組細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞組BGC－823／CDX2的早、晚期凋亡率都有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義。有學者研究CDX2對大腸癌Lovo細胞凋亡率影響時發(fā)現(xiàn)，相比較于轉(zhuǎn)染空載體的Lovo細胞，轉(zhuǎn)染CDX2的大腸癌細胞的凋亡率沒有出現(xiàn)很明顯的區(qū)別，但是相比較于空白細胞組，轉(zhuǎn)染空載體組和轉(zhuǎn)染目的基因組的細胞的凋亡率有一個很小范圍的增長［16］。其他學者的研究實驗結果表明CDX2能夠抑制人結腸癌細胞株SW480和HCT－116細胞增殖，誘導其分化成熟，增加細胞凋亡，增強自噬活性［17］。

CDX2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細胞系BGC－823后引起了許多功能各異的基因的表達上／下調(diào)，這些差異表達基因的功能涉及許多個方面，包括與細胞的增生、分化、侵襲轉(zhuǎn)移和細胞信號轉(zhuǎn)導等。這些上／下調(diào)基因表與CDX2基因之間的關系還需進一步的研究，本研究為下一步的功能研究提供了一些新的線索。

研究結果表明，CDX2過表達明顯抑制胃癌細胞增殖，降低遷移能力，促進細胞凋亡，提示CDX2基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色。因此，在基因治療中，CDX2可以被視為一個潛在的治療靶點，為CDX2參與胃癌的基因治療提供了有力的依據(jù)。

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