超聲輔助固相萃取-HPLC法測(cè)定不同地區(qū)繳獲鴉片樣品中生物堿

劉翠梅，白燕平

（1．中國(guó)人民公安大學(xué)，北京 100038；2．公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心，北京 100193）

超聲輔助固相萃取-HPLC法
測(cè)定不同地區(qū)繳獲鴉片樣品中生物堿

劉翠梅1，2，白燕平2

（1．中國(guó)人民公安大學(xué)，北京 100038；2．公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心，北京 100193）

目的 本文建立了超聲輔助固相萃取-HPLC法定量測(cè)定繳獲鴉片樣品中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀5種生物堿并同時(shí)檢出6種未知化合物的方法。采用主成分分析法區(qū)分不同地區(qū)繳獲的鴉片樣品。方法 采用超聲輔助固相萃取法提取生物堿，XDB-C18（5μm×4.6mm×250mm）色譜柱，流動(dòng)相為10mM的1-庚烷磺酸鈉（pH 3.2）和乙腈，梯度洗脫，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果 該方法的定量限為0.58~2.78 mg/kg。添加水平在0.2～1.5mg/mL范圍內(nèi)，平均加標(biāo)回收率為81.0%～99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～5.0%。結(jié)論 本方法重現(xiàn)性好、定量準(zhǔn)確，滿足定量檢測(cè)鴉片中生物堿含量并對(duì)不同產(chǎn)地鴉片進(jìn)行分類的需要。

超聲輔助固相萃??；主成分分析；鴉片；生物堿

鴉片是一年生草本植物―罌粟未成熟蒴果經(jīng)割傷果皮后，滲出之白色乳汁干燥凝固而得。生鴉片中含有30多種生物堿，其中含量較高的是嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因，此外還含有那碎因、隱晶堿、7-氧二氫蒂巴因、東罌粟堿、牛心果堿、可旦民堿、勞丹尼定、隱晶堿、勞丹素、去甲基勞丹素等其它含量較低的生物堿[1]。

由于受到氣候、土壤、水源等自然環(huán)境的影響，生長(zhǎng)于不同地域罌粟的品質(zhì)有所不同，從而造成不同地域鴉片中所含生物堿的種類和含量有很大的差別。制毒分子從鴉片中提取得到粗制嗎啡，將粗制嗎啡二乙酰化反應(yīng)后制得海洛因。由于受到提取、合成、純化方法的限制，或基于“制毒成本”的考慮，制毒分子制得的粗制嗎啡和海洛因中往往殘留多種鴉片類生物堿，鴉片中生物堿的差異在相應(yīng)的粗制嗎啡和海洛因中也有所體現(xiàn)。因此檢測(cè)鴉片中的生物堿，建立不同地區(qū)鴉片樣品的生物堿含量數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)區(qū)分鴉片的產(chǎn)地、研究粗制嗎啡提取批次、海洛因合成批次、進(jìn)一步細(xì)化海洛因的產(chǎn)地都有很重要的意義。

鴉片樣品中生物堿的萃取方法主要有液液萃取法、固相萃取法、超聲輔助固相萃取法。液液萃取法所需消耗溶劑量大，步驟繁瑣。超聲輔助固相萃取提取結(jié)合了超聲提取時(shí)間短、效率高、操作簡(jiǎn)便和固相萃取所需溶劑量小、可選擇性地去除基質(zhì)干擾、萃取效率高的優(yōu)點(diǎn)，是一種較為理想的生物堿萃取方式[2]。

鴉片生物堿的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、液相色譜法（HPLC）[4-5]、毛細(xì)管電泳法（CE）[6-7]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）[1]，本文采用反相液相色譜法對(duì)鴉片樣品中的5種已知和6種未知生物堿進(jìn)行了檢測(cè)，并嘗試采用主成分分析法對(duì)不同地區(qū)繳獲的鴉片樣品進(jìn)行了分類。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津DGU-20A高效液相色譜儀，超聲波清洗器（KQ 3200E），IKA 渦旋混合器，固相萃取儀（MμLti-SPE M08），氮吹儀（Anke TDL-60B），離心機(jī)（MTN-2800D）陽(yáng)離子交換固相萃取柱（WatersoasisMCX1cc）。

1-庚烷磺酸鈉（純度99.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；其它試劑均為分析純。超純水由Millipore純水系統(tǒng)制備。

鹽酸嗎啡、磷酸可待因、罌粟堿、那可汀、蒂巴因均購(gòu)自國(guó)家藥品生物制品檢定所。

1.2 對(duì)照品溶液配制

將嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、蒂巴因配成10mg/mL儲(chǔ)備液，在5℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1樣品前處理

鴉片樣品于55℃真空干燥，干燥后用瑪瑙研缽研磨均勻。

準(zhǔn)確稱取150mg鴉片樣品，加入7.5mL提取溶劑，超聲 30min，離心，移取上清液，在濾渣中加入7.5mL提取溶劑同法提取第二次，合并兩次上清液。取1mL上清液上陽(yáng)離子交換固相萃取柱。上樣前分別用1mL的甲醇和1mL0.1M的鹽酸對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化。上樣后分別用1mL 0.1M鹽酸和1mL甲醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行淋洗，并抽干溶劑。用氨化甲醇（甲醇-28%氨水，95∶5）1mL，0.5mL 洗脫兩次，收集洗脫液，將洗脫液用氮吹儀40℃吹干，加入1mL甲醇，超聲溶解，過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)HPLC分析。

1.3.2 HPLC分析條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（5μm×4.6mm×250mm），柱溫：40℃，進(jìn)樣體積：3μL，流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。

流動(dòng)相：（A）10mM 1-庚烷磺酸鈉（1.0g溶于390mL水中），用磷酸調(diào)pH為3.2；（B）乙腈。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的pH選擇

流動(dòng)相的pH會(huì)改變生物堿的解離狀態(tài)，從而改變其保留時(shí)間，為此本文考察了不同pH條件下5種生物堿保留時(shí)間的漂移。實(shí)驗(yàn)嘗試了2.8、3.0、3.2、3.4、3.6共5種pH條件，結(jié)果表明pH為2.8、3.0、3.2、3.4時(shí)，保留時(shí)間變化不大，保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為：?jiǎn)岱?.62%，可待因0.26%，蒂巴因0.42%，罌粟堿0.39%，那可汀0.74%。pH為3.6時(shí)5種化合物的保留時(shí)間有較大改變。最終選定的pH為3.2。

2.2 萃取溶劑的考察

不同溶劑對(duì)生物堿的提取效率不同。本文考察了甲醇、80%甲醇/水，50%甲醇/水，2.5%乙酸，5%乙酸這5種常見(jiàn)的提取溶劑的提取效率。稱取50mg鴉片樣品，分別加入5mL提取溶劑，超聲30min，5000r/min離心10min，取上清液過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)HPLC進(jìn)行分析。

結(jié)果表明甲醇的提取效率高于80%甲醇/水和50%甲醇/水。2.5%乙酸和5%乙酸的提取效果相當(dāng)。當(dāng)選用甲醇為提取溶劑時(shí)，蒂巴因、罌粟堿、那可汀的提取效率最高，選用2.5%或5%乙酸時(shí)，嗎啡、可待因的提取效率最高。

2.3 洗脫溶劑的考察

不同洗脫溶劑對(duì)生物堿的洗脫效率也會(huì)有差異。本文考察了采用2.5%乙酸和甲醇為萃取溶劑時(shí)，二氯甲烷/丙酸、氯仿/異丙醇、氨化甲醇三種洗脫溶劑洗脫效果。

方法A：萃取溶劑：2.5%乙酸（上柱前先用氨水調(diào)節(jié)上清液pH為9.0）；洗脫溶劑：二氯甲烷/丙酸（二氯甲烷 ∶丙酸=9∶1）

方法B：萃取溶劑：2.5%乙酸（上柱前先用氨水調(diào)節(jié)上清液pH為9.0）；洗脫溶劑：氯仿/異丙醇（氯仿∶異丙醇=3∶1）

方法C：萃取溶劑：2.5%乙酸，洗脫溶劑；氨化甲醇（甲醇 ∶28%氨水=95∶5）

方法D：萃取溶劑：甲醇，洗脫溶劑；氨化甲醇（甲醇：28%氨水=95：5）

圖1 不同萃取和洗脫溶劑效果圖

由圖1結(jié)果表明，同樣采用2.5%乙酸作為萃取溶劑時(shí)，二氯甲烷/丙酸（A）、氯仿/異丙醇（B）、氨化甲醇（C）三種洗脫體系中氨化甲醇的洗脫效果最好。當(dāng)選用氨化甲醇洗脫體系時(shí)，萃取溶劑在上樣前省去了調(diào)節(jié)pH這一繁瑣的步驟，操作過(guò)程更加簡(jiǎn)便。

方法C和D分別選用2.5%乙酸和甲醇作為萃取溶劑，均采用氨化甲醇作為洗脫溶劑。結(jié)果表明選用方法C時(shí)測(cè)得的嗎啡、可待因含量較高，選用方法D時(shí)測(cè)得的蒂巴因、罌粟堿、那可汀含量較高。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

將嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀配制成0.01mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)樣分析，以樣品峰面積為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表2。在所測(cè)的濃度范圍內(nèi)，5種化合物的線性關(guān)系良好（r≥0.9991）。

按照國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的定義，檢出限以信噪比S/N〉3計(jì)，定量限以S/N〉10計(jì)，將混合生物堿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后進(jìn)樣，得到樣品的檢出限和定量限。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各生物堿的線性范圍和檢出限

2.5 精密度和加標(biāo)回收率的考察

取某一鴉片樣品作為基質(zhì)樣品，分別添加0.2mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL的3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1方法進(jìn)行前處理，每個(gè)濃度水平平行做6次。將測(cè)得的加標(biāo)后樣品中生物堿的含量值扣除樣品本身生物堿的含量值得到添加生物堿的測(cè)定值，該測(cè)定值與理論添加值的比值即為加標(biāo)回收率。各化合物平均加標(biāo)回收率為85%～109%，RSD為1.6%～5.0%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 n=6

3 樣品測(cè)定

選取繳獲地分別為云南、甘肅、河北、貴州、內(nèi)蒙5個(gè)地區(qū)的共58份鴉片樣品，采用甲醇為萃取溶劑，按1.3.3方法進(jìn)行前處理，進(jìn)HPLC分析。

圖2 實(shí)際鴉片樣品的色譜圖

圖2為測(cè)得的某一鴉片樣品的色譜圖，從圖2色譜圖可以看出，除了嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀5種已知的生物堿外，還同時(shí)檢出6未知生物堿類化合物（色譜圖中用1-6標(biāo)記），這6種未知化合物存在于多數(shù)鴉片樣品中，且不同樣品含量差異較大。在后期的工作中，筆者會(huì)嘗試采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、核磁等手段對(duì)這6種未知生物堿進(jìn)行定性分析。

表4為各繳獲地5種生物堿的平均含量，河北、內(nèi)蒙樣品中嗎啡的平均含量最高，云南樣品中嗎啡的平均含量最低。貴州樣品中罌粟堿、那可汀的平均含量最高。

表4 鴉片樣品5種生物堿平均含量匯總表 單位：%

采用主成分分析法對(duì)11種生物堿的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，采用主成分1和主成分2作圖，分類結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同地區(qū)鴉片樣品PCA分類結(jié)果

58份樣品大體分為四組，第一組為內(nèi)蒙和河北樣品，從圖3中也可以看出，與其它樣品相比內(nèi)蒙和河北樣品中嗎啡的平均含量最高、罌粟堿和那可汀的平均含量最低，嗎啡和罌粟堿的平均含量數(shù)值高度一致。第二組為貴州樣品，這些樣品的罌粟堿、那可汀平均含量最高。云南的樣品大致分為差異顯著的兩組，這兩組樣品間罌粟堿和那可汀的含量有較大差異。甘肅樣品較分散，散落在河北與貴州樣品之間。

4 結(jié)論

本文建立了超聲輔助固相萃取-液相色譜分析不同地域繳獲鴉片樣品中生物堿的方法。超聲輔助固相萃取法快速、高效、消耗萃取溶劑少、操作簡(jiǎn)便，是較為理想的萃取方法。文中考察了幾種常見(jiàn)的萃取和洗脫溶劑，結(jié)果表明采用甲醇或2.5%乙酸進(jìn)行萃取，氨化甲醇進(jìn)行洗脫的操作簡(jiǎn)便、效率超高。本方法可定量測(cè)定繳獲鴉片樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀和蒂巴因，并同時(shí)檢出6種未知生物堿。采用利用主成分分析法分析這11種生物堿數(shù)據(jù)，可將58份不同地域繳獲的鴉片樣品大致分成差異明顯的4類。

在后期的工作中，筆者將采用該方法開(kāi)展對(duì)近三年全國(guó)繳獲的鴉片樣品的分析工作，初步建立我國(guó)繳獲鴉片樣品生物堿含量數(shù)據(jù)庫(kù)。逐漸增加的鴉片樣品的生物堿信息將對(duì)現(xiàn)有分類結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證或修正，從而實(shí)現(xiàn)采用鴉片樣品的生物堿分析結(jié)果判別鴉片樣品產(chǎn)地的目的。

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Determination of Opium Alkaloids by HPLC with Ultrasound Assisted Solid Phase Extraction and Its Application in Source Identification

LIU Cui-mei1，2，BAI Yan-ping2
（1.Chinese People’s Public Security University，Beijing 100038，China；2.The Drug Intelligence and Forensic Center of Minister of Public Security，Beijing 100193，China）

Objective To develop a rapid and reliable method for simultaneous determination of morphine， codeine， thebaine，papaverine，noscapine and 6 other unknown compounds in seized opium samples by high performance liquid chromatography with ultrasonic assisted solid phase extraction.Method Ultrasonic assisted solid phase extraction was used to extract alkaloids.Target analytes were separated on a XDB-C18 column （5 μm×4.6 mm×250 mm）， and were gradiently eluted with the binary mobile phase containing 10 mM sodium heptane-1-sulphonate （pH3.2） and acetonitrile.Results LOQ of different alkaloids ranged from 0.58 to 2.78 mg/mL.Recoveries at 0.2-1.5 mg/mL ranged from 81.0%-99.2%and RSD%was 1.6%-5.0%.The PCA divided 58 seized samples into 4 groups.Conclusion The established method is of high reproducibility and accuracy.It can be applied to determining the alkaloids in opium samples and discriminating different sources of opium.

ultrasound assisted solid phase extraction；principle component analysis（PCA）；opium；alkaloid.

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2013.02.008

1671-2072-（2013）02-0031-04

2012-11-11

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAK04B06）

劉翠梅（1983—），女，博士研究生，主要從事毒品原產(chǎn)地和關(guān)聯(lián)性判別分析研究。E-mail：liucuimei123@yahoo.cn。

卓先義）

鑒定實(shí)踐Forensic Practice