棕櫚酰五肽-3的固相合成

王小青，趙紅玲，高 楊，王良友，尹志峰

(河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所，河北承德 067000)

皮膚真皮中膠原蛋白減少被認為是人體衰老形成皺紋的主要原因，因此，如果能夠促進皮膚合成更多的膠原蛋白，那么將會有效逆轉衰老從而減少皺紋。小分子多肽類用于抗皺產品已經(jīng)有很多年[1-2]。每年都有大量多肽類抗皺的產品上市，從早期的乙?；鍎匐牡阶貦磅９央?。棕櫚酰五肽-3(Matrixyl)是棕櫚酰寡肽系列抗皺多肽小分子的一種。

Matrixyl中的活性小分子是“微膠原蛋白”，該小分子多肽通過含有Matrixyl的乳膏深入皮膚，到達成纖維細胞。在成纖維細胞合成皮膚連接組織的小分子，如膠原蛋白和蔗糖糖胺，這些合成的分子參與構成皮膚基質[3]。

本研究采用Fmoc固相多肽合成法，用逐步縮合的策略合成了由5個氨基酸以及一個棕櫚酸組成的棕櫚酰五肽-3，合成路線[3-4]。見附圖。

附圖 棕櫚酰五肽-3合成路線圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 ALLtechPH426型反相高效液相色譜儀(UV檢測器，美國Alltech公司);Newstyle型反相高效半制備液相色譜儀(蘇州漢邦科技有限公司);Agilent1200系列高效液相-ESI質譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);Heal Force系列純水機(香港力康公司);CHRIST凍干機(北京博勵行儀器有限公司);高速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠);752型紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司);AR224CN型分析天平(美國奧豪斯儀器上海有限公司)。

1.2 藥品與試劑 Wang-Resin(天津南開合成科技有限公司，替代度為1.17mmol/g);3種Fmoc保護基的氨基酸(蘇州中科天馬肽工程中心有限公司)、棕櫚酸(國藥試劑有限公司);1-羥基苯并三氮唑(HOBt)(蘇州中科天馬肽工程中心有限公司)，N, N-二異丙基碳二亞胺(DIC);哌啶，三氟乙酸(TFA)，苯甲硫醚(國藥試劑有限公司)，苯甲醚，乙二硫醇(EDT)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，冰乙醚和二氯甲烷(DCM)，以上試劑均為分析純;乙腈(色譜純，天津科密歐試劑有限公司)，超純水(實驗室自制)。

2 檢測方法、制備、裂解與鑒定

2.1 替代度檢測方法 精密稱取干燥至恒重的AAWang Resin2份，各約8.0mg，分別置于2ml離心管中，加入20%哌啶DMF溶液(V:V)溶液1ml，室溫振蕩20min，脫去Fmoc保護基。取離心管上清液200μl置于10ml比色管中，DMF 10ml稀釋、搖勻，待測。將20%哌啶DMF溶液(V:V)200μl用10ml DMF稀釋、搖勻，作為空白對照。于波長301nm處，用紫外分光光度計測定各溶液的吸收值(A)。按照公式 計算替代度，式中，A為測得的吸光度值;51為稀釋倍數(shù);Sub為每克樹脂中連接的氨基酸的毫摩爾數(shù);ε為Fmoc結構在301nm處的特征吸收值，本實驗室校正值6 L(mmol×cm)-1;m為稱取的樹脂質量(單位為mg)。

2.2 茚檢方法 固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，試劑包括:6%茚三酮的乙醇溶液、80%苯酚的乙醇溶液、2% 0.001M KCN的吡啶溶液，配制中的吡啶需要加茚三酮回流，重蒸后再使用。

取少量樹脂，加入A、B和C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有藍色，樹脂出現(xiàn)藍色或紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。

2.3 HPLC-MS 分析方法:色譜條件:色譜柱為Accurasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm);流動相為A:0.1%TFA/H2O，B:0.1% TFA/CH3CN，5%-95%B 梯度洗脫20min，流速為0.2ml/min，檢測波長為215nm，樣品濃度1mg/ml，進樣量10μl。質譜條件:掃描范圍100-1200。

2.4 Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin的制備把1.71g Wang Resin投入到反應柱中，DMF洗滌一次，抽干;用適量干燥二氯甲烷常溫溶漲，N2吹拂攪拌30min至樹脂充分溶脹，抽干液體;DMF洗滌一次，抽干;重蒸DMF洗滌一次，抽干。加入3.07g Fmoc-Gly-OH、1.30g HOBt、1.49ml DIC的DMF/DCM(1:1)溶液5ml。反應5min后，加入0.10g DMAP，反應4h。反應結束后，抽干反應液，用DMF洗滌三次抽干，取出少許樹脂進行替代度檢測。隨后加入200ml封閉試劑(AC2O/吡啶(7:6，V:V))，反應8-16h，DMF洗滌2次;無水甲醇洗兩次(10min/次)，真空減壓干燥至恒重。測得Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin的替代度為0.71mmol/g。

2.5 Matrixyl-Wang Resin的 制 備 ① 在Fmoc-Ser(tBu)-Wang Resin反應柱中，加入DCM溶漲20-30min，抽掉。加入DBLK溶液(哌啶/DMF(V/V)=1:4)脫保護2次(5+10min)，兩次脫保護之間需加入DMF洗滌1min，抽掉。兩次脫完保護抽掉后再用DMF，甲醇，DCM，DMF，各洗滌1次，用玻璃棒挑取少許樹脂，茚檢，顯深紫紅色，表明Fmoc已脫，待投料。②在脫保護的過程中，稱取2.93g Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.81g HOBt置燒杯中，加入2ml精制DMF溶解，待完全溶解后，將燒杯放入冰浴中冷卻2min，然后再加入0.93ml DIC于溶液中活化8min，若出現(xiàn)白色絮狀泡沫表明活化已完全，用布氏漏斗將活化液中的白色固體小顆粒濾去，將得到的澄清濾液倒入反應柱中，再加入DMF于反應柱中，調節(jié)好N2，使樹脂被均勻吹起，套上干燥管，并要保持在反應過程中無掛壁現(xiàn)象出現(xiàn)，若出現(xiàn)掛壁，用少許精制DMF將壁上的樹脂沖到反應液中。室溫反應2h，茚檢合格后可抽掉反應液繼續(xù)連接下一個氨基酸。

2.6 Matrixyl-Wang Resin的裂解 將干燥至恒重的Matrixyl-Wang Resin0.10g置于玻璃燒瓶中，冰浴攪拌下加入TFA-苯甲硫醚-苯甲醚-EDT(體積比95:5:3:2)4ml，反應30min，逐漸升至室溫，于室溫下反應2h。過濾，用少許TFA洗滌樹脂，將濾液傾入40ml無水冰乙醚中，析出白色固體，4000rpm離心4min，棄去上清液，重復2次，真空干燥，得粗肽46.6mg。

2.7 Matrixyl粗肽的分析鑒定 粗品Matrixyl進行RPHPLC分析，純化后Matrixyl的HPLC-ESI-MS分析可知其m/z 402.3{[M+H]2+}，Matrixyl的分子量為802.05，理論值與實際值相符。

3 討論

棕櫚酰五肽-3為短肽，為提高最終產量，應盡可能提高替代度。本研究對反應時間、縮合試劑以及氨基酸比例等多種因素進行優(yōu)化，最終使替代度達到0.71mmol/g，相當于替代86.6%。

本研究對棕櫚酰五肽-3 的裂解試劑進行了優(yōu)化，對幾種裂解液配比進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)TFA-苯甲硫醚-苯甲醚-EDT(體積比95:5:3:2)配比裂解后純度高，雜質少，易于純化，使本次實驗能夠得到純度較高的棕櫚酰五肽-3，為棕櫚酰五肽-3的固相合成研究提供一種可行的方法。

[1] 李校坤,姚成燦,黃亞東,等.生物活性多肽護膚品的基礎及應用[J].日用化學工業(yè),2002,32(5):41-44.

[2] 鐘星,郭建維,成秋桂.勝肽在化妝品中的應用和最新進展[J].日用化學品科學,2012,35(11):35-38.

[3] Fields K,Falla TJ,Rodan K,et al.Bioactive peptides:signaling the future[J].Cosme Dermatol,2009,8(1):8-13.

[4] 王德心.活性多肽與藥物開發(fā)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2011.442.

[5] 厲保秋.多肽藥物研究與開發(fā)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.51-67.