抗人類免疫缺陷病毒廣譜中和抗體與疫苗設(shè)計(jì)

王若珂，郭建影，張林琦

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院艾滋病綜合研究中心，北京 100084

自從1983年人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)被分離以來(lái)[1]，人們不斷努力研發(fā)抵御HIV感染的疫苗。HIV-1具有高度變異、表面受糖基化保護(hù)、病毒顆粒表面的膜蛋白稀少的特點(diǎn)[2]。以往成功的疫苗以減毒、滅活的病毒作為疫苗，或用基因工程的方式將病毒的一部分作為疫苗。HIV-1的滅活和減毒疫苗因?yàn)榘踩詥栴}而無(wú)法實(shí)施。將HIV-1膜蛋白作為免疫原確實(shí)可誘生HIV-1特異性抗體，但這些抗體只能中和自體病毒，無(wú)交叉保護(hù)作用。這些因素都使得傳統(tǒng)的疫苗策略不再適用。最近的RV144疫苗獲得了30%的保護(hù)性[3]，使人們?cè)诳拱滩≈袀涫芄奈?，但該疫苗的保護(hù)性差強(qiáng)人意。因此，人們必須從更全面和深入的層次研究保護(hù)性免疫反應(yīng)，這樣才能研制出更有效的疫苗[4]。

研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)HIV-1疫苗策略很難誘導(dǎo)廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibody，bnAb)，但10%～30%的患者在感染2年后血清中可出現(xiàn)針對(duì)不同病毒的中和活性。通過評(píng)價(jià)，將血清廣譜性和中和活性特別強(qiáng)的患者(約1%)稱為“精英患者”[2]，他們的血清在體外可中和多種亞型的HIV-1，輸送給動(dòng)物模型能使其免于HIV-1感染，從而產(chǎn)生被動(dòng)保護(hù)[5]。

深入探索這些患者的免疫系統(tǒng)如何產(chǎn)生廣譜中和抗體，通過疫苗重現(xiàn)廣譜中和抗體的發(fā)生過程，這是當(dāng)今艾滋病研究領(lǐng)域內(nèi)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

1 抗HIV廣譜中和活性抗體篩選的新技術(shù)

血清中的廣譜中和活性，可能是多種單克隆抗體產(chǎn)生的協(xié)同作用，也可能是有限的幾種單克隆抗體所發(fā)揮的作用。如果有這種單克隆抗體存在，其是否能強(qiáng)到阻止個(gè)體感染HIV-1？近幾年的研究表明，具有廣譜中和活性的單克隆抗體在體內(nèi)是存在的，但不能完全排除多個(gè)抗體協(xié)同的抗病毒作用。

早些年研究者分離出一些能中和多個(gè)HIV-1亞型的抗體，其中b12是Burton等[6,7]用HIV-1陽(yáng)性患者骨髓所建立的噬菌體表面展示Fab庫(kù)與gp120膜蛋白結(jié)合的方式篩選得到的，為非自然抗體，其抗體重鏈和輕鏈可能來(lái)自不同的B細(xì)胞。2F5、4E10、2G12是Buchacher等[8]將患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)永生化，再用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)篩選IgG陽(yáng)性和HIV-1陽(yáng)性細(xì)胞系得到的。近10年來(lái)，人們逐漸分離獲得更廣譜、更高中和活性的單克隆抗體，尤其是近5年來(lái)分離的中和抗體在廣譜性和中和活性方面有了極大提高[4]。

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)可直接通過B細(xì)胞表面標(biāo)記分子分離到符合要求的記憶B細(xì)胞。Nussenzweig等[9]發(fā)展了通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)和特異性引物設(shè)計(jì)，克隆出單個(gè)B細(xì)胞抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)的方法；并在近2年改進(jìn)了引物設(shè)計(jì)，克隆出的可變區(qū)包含更多的原有突變位點(diǎn)。將可變區(qū)克隆到含有對(duì)應(yīng)恒定區(qū)的載體上并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得可純化的并保持特異性的抗體。

如果通過記憶細(xì)胞直接獲得IgG，可避免構(gòu)建大量抗體基因的克隆，實(shí)現(xiàn)高通量的B細(xì)胞初篩。Walker等[10]將記憶B細(xì)胞以1.3個(gè)/孔的密度分選到384孔板中，刺激并培養(yǎng)8 d后，用培養(yǎng)上清液進(jìn)行親和試驗(yàn)及中和試驗(yàn)篩選B細(xì)胞。Kwakkenbos等[11]對(duì)記憶B細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化，將每6～8個(gè)記憶 B細(xì)胞分到一個(gè)孔中，并通過引入Bcl-6和Bcl-xL及Tfh幫助分泌大量IgG。Walker等[10]改進(jìn)96孔板中和試驗(yàn)，在384孔板上用15 μ l上清液進(jìn)行，使以往復(fù)雜的抗體中和試驗(yàn)變得更加高通量。

僅靠親和性篩選可能會(huì)篩出無(wú)交叉中和活性的抗體。大量免疫原性高的可變區(qū)表位隱藏了真正的中和表位。除直接用中和特性篩選記憶B細(xì)胞外，研究人員還設(shè)計(jì)了只含有保守表位的特異性釣餌，如RSC3、2CC等，釣出了一系列具有很好廣譜中和活性的抗體，如VRC01[4]。其他實(shí)驗(yàn)室也有用gp41的近膜胞外結(jié)合區(qū)域(membrane-proximal external region，MPER)做釣餌，分選記憶B細(xì)胞，但篩出的抗體廣譜性較差。

利用高通量測(cè)序可獲得大量抗體重鏈或輕鏈可變區(qū)的序列，據(jù)此推測(cè)廣譜中和抗體的親和成熟過程，對(duì)研究病毒逃逸與抗體進(jìn)化的關(guān)系、疫苗的研發(fā)具有重要啟示。然而，抗體高通量測(cè)序的弊端是無(wú)法得到一一對(duì)應(yīng)的抗體重鏈和輕鏈序列[12]。

2 HIV-1廣譜中和抗體

廣譜中和抗體所識(shí)別的HIV-1膜蛋白敏感區(qū)域可分為四大類(表1)：gp120(識(shí)別CD4并與其結(jié)合，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化暴露膜融合位點(diǎn))與CD4結(jié)合的部位 (CD4 binding site，CD4bs)、可變區(qū)1和2(variable regions 1 and 2，V1V2)的糖基化位點(diǎn)、可變區(qū)3(variable region 3，V3)的糖基化位點(diǎn)、gp41(介導(dǎo)膜融合)的MPER(圖1)。分離出的具有代表性的廣譜中和抗體及其分類詳細(xì)介紹如下。

表1 HIV-1廣譜中和抗體的分類和特征[2]

Tab.1 Categories and features of HIV-1 bnAbs

bnAbsBreadthIC80(μ g/ml)Recognition featuresGenetic charactersSimilar nAbsCD4bs b1233%2.70Sensitive to V1 and V2 substitu-tions D368R,E370R,D477VDerived from phage library NA HJ1630%0.77Proximity of the CD4bs b12 epitope NA VRC0187%0.98CD4 mimicryVH1-2,5 amino acids length of CDRL3 VRC02, VRC03, NIH45-46, 3BNC60, BNC62, 3BNC117, 12A12, 12A21, 12A30, VRC-PG04, VRC-CH31 8ANC13157%4.02CD4 mimicryVH1-46,5 amino acids length of CDRL38ANC37, 8ANC134 CH10334%8.00CDR H3 mode of recognition and reasonable affinity maturationNRV1V2 PG970%0.31Preferred binding to trimeric Env Extended CDRH3 (28 amino acids)PG16,CH01-04 PGT14560%0.31Discontinuous conformational epitopesPGT141-144V3 2G1218%4.85Glycan only recognitionNR PGT12153%0.08Recognizes V1/V2 and V3 glycansPGT122,PGT123 PGT12856%0.11Recognizes V3 glycanPGT125-127, PGT130,PGT131 PGT135<30%NRRecognizes V3 and V4 glycansIGHV4-39, IGKV3-15PGT136,PGT137MPER 2F548%9.42ELDKWAS peptide recognitionm66 4E1088%8.98Sequence before transmembrane domain NR 10E897%2.05A narrow stretch of highly con-served gp41-hydrophobic resi-dues7H6 Z13<20%NRWNWFDITN peptide recognitionDerived from phage libraryNR

NA, not applicable; NR, not reported in the literature.

圖1 HIV-1廣譜中和抗體在膜蛋白上的表位示意圖[4]

Fig.1 Major vulnerable sites on HIV-1 recognized by bnmAbs

2.1 識(shí)別CD4bs表位的抗體

為了保證感染過程，病毒與受體CD4結(jié)合的區(qū)域CD4bs必須非常保守，一直被認(rèn)為是廣譜中和抗體很好的靶點(diǎn)。然而，自從利用酵母展示的抗體庫(kù)篩出針對(duì)CD4bs的b12以后，很長(zhǎng)時(shí)間都未再篩選到CD4bs抗體，且由于b12僅重鏈參與表位結(jié)合，輕鏈不參與，人們懷疑這種抗體是否可天然產(chǎn)生。

2009年Corti等[13]用改進(jìn)的EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)永生化記憶B細(xì)胞的方法，結(jié)合多種重組形式的HIV-1膜蛋白進(jìn)行篩選，得到了抗體HJ16。其表位鄰近b12表位，但不重疊，廣譜性與b12和2F5相當(dāng)。HJ16識(shí)別的表位與抗核心抗體相似，位于gp120外側(cè)區(qū)與內(nèi)側(cè)區(qū)之間的α 5螺旋。

Wu等[14]改造HIV-1膜蛋白，去除V1V2、V3區(qū)域和C端的一部分，僅保留CD4bs的結(jié)合區(qū)域，將其他表面抗原區(qū)域用猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)或其他非HIV-1的病毒殘基代替。以蛋白R(shí)SC3作為釣餌分選HIV感染患者的記憶B細(xì)胞，分選出與RSC3結(jié)合但無(wú)法與突變的Δ RSC3結(jié)合的記憶B細(xì)胞，獲得了VRC01、VRC02、VRC03共3個(gè)單克隆抗體。其中VRC01是最有效的中和抗體，能中和173種HIV-1病毒株。VRC01模仿了CD4與gp120的結(jié)合，73%的CD4 N端區(qū)域與VRC01重疊，最初的CD4接觸位點(diǎn)中有98%被VRC01覆蓋。gp120的V5區(qū)和loop D的氨基酸改變的病毒突變體對(duì)VRC01天然耐受，說(shuō)明這些區(qū)域是VRC01識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)。同時(shí)它還識(shí)別276位的N多糖[15]。此后，科學(xué)家們用類似方法篩選了大量具有廣譜中和抗體的患者，獲得了一系列廣譜中和抗體，包括從74號(hào)患者中篩出的VRC-PG04、 VRC-PG04b[16]，從CH0219患者中篩出的VRC-CH30-34[17]。PG04可中和178株HIV-1病毒株中的76%，中和活性和廣譜性與PG9相當(dāng)。與VRC01相比，VRC-PG04抗體與gp120的結(jié)合并沒有促進(jìn)輔助受體表位的暴露，由此認(rèn)為CD4bs抗體也可通過不同方式識(shí)別和靠近CD4bs，CD4bs抗體對(duì)CD4的模擬與中和活性并無(wú)明顯相關(guān)性。VRC-CH30-34的重鏈同樣來(lái)源于IGHV1-2*02，具有80%～90%的廣譜中和性。

Scheid等[18]用CD4結(jié)合狀態(tài)下缺少V1V2和V3區(qū)的gp120糖蛋白(2CC)及YU-2 gp140三聚體作為釣餌，分選4例血清廣譜中和能力很強(qiáng)患者的記憶B細(xì)胞。2CC除釣取CD4bs抗體外，還可將結(jié)合CD4誘導(dǎo)表位(CD4-induced epitope，CD4i)的抗體篩選出來(lái)。分離的NIH45-46、3BNC60、8ANC131、12A12等CD4bs抗體均可模擬CD4與gp120的結(jié)合，暴露輔助受體的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)CD4i抗體的結(jié)合。值得注意的是，3BNC117平均80%抑制濃度(80% inhibitory concentration，IC80)值達(dá)0.3 μ g/ml，比VRC01有更好的廣譜性和高效性。VRC01的突變體NIH45-46是利用YU-2 gp140三聚體篩選出的，NIH45-46和gp120的共結(jié)晶分析顯示，NIH45-46在CDRH3有4個(gè)氨基酸插入，增強(qiáng)了NIH45-46與gp120內(nèi)側(cè)區(qū)的結(jié)合。NIH45-46的中和活性比VRC01更高，但不如3BNC117。而8ANC195識(shí)別的表位不是傳統(tǒng)的CD4bs位點(diǎn)。

2.2 識(shí)別V1V2和V3表位的抗體

2009年Walker等[10]用標(biāo)記CD3、CD14、CD16、IgM、IgA、IgD的磁珠富集IgG陽(yáng)性記憶B細(xì)胞，用gp120、gp41進(jìn)行ELISA陽(yáng)性篩選，同時(shí)用高通量的中和試驗(yàn)篩選，獲得2個(gè)中和抗體PG9和PG16，可分別中和162株HIV-1不同亞型毒株中的127株和119株，而對(duì)B亞型中和效果較差。競(jìng)爭(zhēng)ELISA和突變株中和試驗(yàn)表明，PG9和PG16識(shí)別位點(diǎn)位于gp120上V2、V3的保守區(qū)域，且V2中156和160位上的天冬酰胺起關(guān)鍵作用，傾向于與三聚體結(jié)合，而與gp120、gp41單體不結(jié)合。

PGT系列抗體分離的方法與PG9相同，從4例“精英患者”中篩選出18個(gè)中和抗體，分別是PGT121～PGT123、PGT125～PGT131、PGT135～PGT137、PGT141～PGT145，其中多個(gè)抗體的中和活性比PG9、VRC01等強(qiáng)約10倍。同一患者中的不同克隆均由相同B細(xì)胞高頻突變而來(lái)，且效價(jià)不同，如PGT131、 PGT136、 PGT137、 PGT144比其他相同來(lái)源的克隆IC50值大10～50倍。有的突變抗體之間中和活性相似但廣譜性不同，如PGT128與PGT125～PGT127中和活性相似，但更加廣譜。PGT135～PGT137在分離出的抗體中廣譜性較差，但仍可高效中和30%的HIV-1 C亞型病毒。PGT141～PGT145抗體有明顯結(jié)合HIV膜蛋白三聚體的趨勢(shì)；而其他單克隆抗體可結(jié)合gp120單體，且均競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合2G12。此外，PGT135～PGT137還競(jìng)爭(zhēng)V3特異性單克隆抗體。所有單克隆抗體無(wú)法結(jié)合去糖基化的gp120。實(shí)驗(yàn)證明，PGT125～PGT128、 PGT130特異性結(jié)合Man8GlcNAc2和Man9GlcNAc2。與2G12不同的是，它們不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合甘露糖或Man4，提示不同的糖識(shí)別模式。假病毒突變中和試驗(yàn)證明，332和(或)301位點(diǎn)的N多糖對(duì)中和識(shí)別有重要作用。在gp120上糖的排布位置也對(duì)中和識(shí)別活性起關(guān)鍵作用。PGT系列抗體識(shí)別的新表位可能會(huì)成為疫苗設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)[19]。

借助于結(jié)合分離記憶B細(xì)胞、單克隆和多克隆培養(yǎng)、單細(xì)胞分選、EBV轉(zhuǎn)化和重組抗體生產(chǎn)，Bonsignori等[20]從HIV-1 A亞型感染患者中的IgG陽(yáng)性記憶B細(xì)胞中獲得CH01～CH04中和抗體。CH01～CH04可中和91株HIV-1 tier2 假病毒中的38%～49%毒株，而未突變的B細(xì)胞原型的抗體只能中和16%的假病毒，與E.A244株gp120的親和性可激活B細(xì)胞。這些抗體有相同的V(D)J重排、HCDR3長(zhǎng)度(24個(gè)氨基酸殘基)及相似的HCDR3、LCDR3，重鏈突變頻率為11.5%～14.3%，識(shí)別的空間構(gòu)象與PG9/PG16相似。不同的是，它們對(duì)127、159、171和181位具有中和敏感性，推測(cè)CH01～CH04結(jié)合分散的表位，或從不同方向結(jié)合PG9/PG16的表位。CH03有自身反應(yīng)性，CH01～CH03有多反應(yīng)性。值得注意的是，CH01～CH03與分離得到針對(duì)CD4bs的抗體VRC-CH31均來(lái)自同一患者CH0219[21]。這2類抗體的廣譜性涵蓋了患者血清的廣譜性，能中和95%的病毒亞型，為設(shè)計(jì)可誘生多位點(diǎn)廣譜中和活性的多價(jià)疫苗提供了依據(jù)。

在接種RV144疫苗的人群中，針對(duì)gp120的V1V2中和抗體的存在與HIV-1感染率呈明顯負(fù)相關(guān)。針對(duì)V1V2的中和抗體在免疫人群中具有保護(hù)性，說(shuō)明了V1V2表位的重要性[22]。

2.3 識(shí)別MPER表位的抗體

1994年Buchacher等[8]將HIV-1感染者的PBMC通過雜交瘤細(xì)胞永生化，篩選出2F5和4E10，其識(shí)別MPER的線性表位，通過抑制HIV-1膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的融合發(fā)揮中和作用，2F5和4E10均有較強(qiáng)的自身反應(yīng)性。有觀點(diǎn)認(rèn)為針對(duì)MPER的中和抗體難以產(chǎn)生是由于其祖先在發(fā)育早期免疫耐受形成時(shí)被清除。但也有觀點(diǎn)認(rèn)為其自身反應(yīng)性是在免疫耐受形成后，通過體細(xì)胞高頻突變獲得的，沒有被免疫耐受清除[4]。2001年Zwick等[23]用具有廣譜中和血清的患者骨髓RNA構(gòu)建噬菌體展示的抗體庫(kù)，用MN多肽鏈 (LLELDKWASLWNWFDITNWLW)經(jīng)過6輪親和力篩選，得到中和抗體Z13，能中和HIV-1 B、CE亞型的一些病毒株。Nelson等[24]通過突變庫(kù)篩選獲得Z13的突變體Z13e1，比Z13的親和性高100倍，同時(shí)具有高中和活性。

2012年Huang等[25]培養(yǎng)“精英患者”的記憶B細(xì)胞，從16 500個(gè)B細(xì)胞中分離獲得10E8抗體。雖然也是針對(duì)MPER區(qū)域，但并沒有與脂類結(jié)合和自身反應(yīng)的特性，且廣譜性達(dá)到98%，平均IC50值為0.35 μ g/ml。10E8 Fab與MPER肽段結(jié)構(gòu)復(fù)合體顯示MPER形成100o夾角的2個(gè)α 螺旋，10E8主要結(jié)合gp41疏水氨基酸殘基和跨膜區(qū)之前的第681位氨基酸。78例患者中有8%產(chǎn)生了類似10E8特異性的抗體。

2.4 HIV-1廣譜中和抗體的特征

HIV-1廣譜中和抗體的特征為IgG突變率高，且CDRH3較長(zhǎng)。人IgG抗體重鏈可變區(qū)大多含有10～20個(gè)堿基突變，交叉中和活性的HIV-1特異性IgG重鏈可變區(qū)的堿基突變提高了1倍，而廣譜中和抗體的突變達(dá)到80個(gè)之多。有些抗體存在罕見的插入或缺失突變[12]。VRC01類抗體在抗體框架區(qū)也積累很多突變[4]。許多廣譜中和抗體的天然B細(xì)胞無(wú)法被HIV-1膜蛋白激活，推測(cè)可能廣譜中和抗體的親和力成熟途徑復(fù)雜，激活這些天然B細(xì)胞的有可能是其他病菌或自身蛋白[26]。B細(xì)胞VDJ重排過程中形成較長(zhǎng)CDRH3的概率比較小，且在B細(xì)胞成熟過程中會(huì)因自身反應(yīng)而清除大部分。CDRH3較長(zhǎng)的抗體易出現(xiàn)自身反應(yīng)性和多反應(yīng)性。記憶B細(xì)胞中多反應(yīng)性抗體的比例為23%左右，但HIV-1膜蛋白特異性的抗體中多反應(yīng)性抗體比例高達(dá)70%[4]。

3 HIV疫苗設(shè)計(jì)啟示

隨著人們對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)及其表位與廣譜中和單抗復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析，研究人員試圖通過膜蛋白的改造(截掉可變區(qū)、增加糖基化、增強(qiáng)空間構(gòu)象穩(wěn)定性等)盡量維持表位正確的折疊構(gòu)象，還可避免非自然表位和非中和表位的暴露，以獲得較好的免疫效果。如截去gp41跨膜區(qū)后的gp140形成三聚體結(jié)構(gòu)，且嵌入序列加強(qiáng)三聚體的形成和穩(wěn)定；去掉V3等免疫原性強(qiáng)的區(qū)域，減少非廣譜中和抗體產(chǎn)生；引入計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的突變，將gp120單體的核心區(qū)進(jìn)行改造去除內(nèi)側(cè)區(qū)的表位， 使更多糖基化掩蓋其他表位；直接截去內(nèi)側(cè)區(qū)序列；或選擇較小的結(jié)構(gòu)域，如CD4-binding β -15 loop或 MPER連到其他蛋白上作為骨架穩(wěn)定表位[27]。

圖2激活特定廣譜中和抗體初始B細(xì)胞的疫苗策略[31]

Fig.2 Vaccine strategies to activate na?ve B cells to produce bnAbs

研究人員還從廣譜中和抗體發(fā)生過程的角度設(shè)計(jì)并改造HIV-1膜蛋白。Georgiev等[28]分析了30個(gè)中和抗體與34個(gè)HIV-1亞型的中和相關(guān)性，對(duì)患者血清中針對(duì)各個(gè)表位的中和活性抗體的貢獻(xiàn)進(jìn)行初步量化，發(fā)現(xiàn)有些患者血清的中和活性主要針對(duì)一個(gè)膜蛋白的保守表位，而其他患者體內(nèi)的抗體可針對(duì)2個(gè)甚至更多HIV-1膜蛋白靶點(diǎn)[4]。

Zhou等[12]對(duì)5例血清中有VRC01類抗體的患者進(jìn)行高通量測(cè)序和抗體結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)各患者中VRC01類抗體的成熟過程非常接近。每個(gè)個(gè)體中的VRC01類抗體都來(lái)源于一個(gè)或幾個(gè)天然B細(xì)胞。產(chǎn)生VRC01類抗體的天然B細(xì)胞存在于正常人體內(nèi)的概率很大。通過設(shè)計(jì)HIV-1膜蛋白抗原，激活CD4bs抗體的初始B細(xì)胞，可增加產(chǎn)生CD4bs廣譜中和抗體的可能性。如果進(jìn)一步刺激使抗體向識(shí)別CD4bs表位定向進(jìn)化，可誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4bs類抗體。Jardine等[29]借助于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)并改造gp120膜蛋白，通過多個(gè)CD4bs廣譜中和抗體與其初始B細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行體外篩選，獲得eOD-GT6抗原，可激活CD4bs廣譜中和抗體的初始B細(xì)胞；McGuire等發(fā)現(xiàn)[30]，如果將位于膜蛋白D環(huán)和V5區(qū)的2個(gè)糖基化位點(diǎn)除去，此膜蛋白就可識(shí)別并激活VRC01的初始B細(xì)胞。他們認(rèn)為是糖基化遮擋了初始B細(xì)胞的識(shí)別。這些嘗試性研究為疫苗的初免免疫原設(shè)計(jì)起指導(dǎo)作用。然而，這些B細(xì)胞后續(xù)進(jìn)化為識(shí)別CD4bs表位需多步免疫加強(qiáng)，突出保守表位。如何誘導(dǎo)出針對(duì)CD4bs的廣譜中和抗體還需進(jìn)一步探索(圖2)。

Liao等[31]研究了CH505患者的病毒-中和單克隆抗體CH103共進(jìn)化的過程。CH103經(jīng)歷13%～17%的突變獲得了55%的中和廣譜性，并隨突變獲得了多反應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，CH103的初始B細(xì)胞可結(jié)合感染病毒(founder virus)的膜蛋白，但無(wú)法結(jié)合異源病毒膜蛋白和RSC3。30、53、78周自體病毒膜蛋白失去了對(duì)CH103初始B細(xì)胞的結(jié)合能力，只結(jié)合過渡的抗體和CH103～CH106。而78周后出現(xiàn)的2個(gè)膜蛋白突變，使其失去了與過渡抗體和CH103～CH106抗體的結(jié)合力，病毒的逃逸有助于血清廣譜性產(chǎn)生。研究人員認(rèn)為，CH505患者在感染6個(gè)月，病毒膜蛋白就在CH103抗體譜系的表位區(qū)域(CD4bs)積累了大量突變，而其他患者在1年后才出現(xiàn)此位置的突變，這可解釋CH505患者體內(nèi)較早產(chǎn)生廣譜中和抗體的現(xiàn)象。由此提出免疫策略：CH505患者感染病毒的膜蛋白可作為初免，再用不同時(shí)間點(diǎn)的自體病毒膜蛋白加強(qiáng)免疫，重現(xiàn)HIV-1感染者體內(nèi)抗體親和力成熟與病毒逃逸過程，這有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)(圖3)。

圖3順序免疫精英患者逃逸病毒Env的疫苗策略[4]

Fig.3 Vaccine strategies based on sequential immunization

Moore等[32]在CAP256患者中也對(duì)病毒逃逸和抗體進(jìn)化做了細(xì)致研究。該患者在感染HIV-1 C亞型3個(gè)月后，被V2區(qū)抗體敏感的HIV-1重復(fù)感染，初次感染和重復(fù)感染的病毒在體內(nèi)發(fā)生重組，最終患者產(chǎn)生了針對(duì)V2區(qū)R166、K169及高效廣譜的中和抗體。針對(duì)V1V2的自身抗體用11周就進(jìn)化為針對(duì)相同區(qū)域的中和重復(fù)感染病毒的高效價(jià)抗體，說(shuō)明免疫系統(tǒng)可短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)V2區(qū)的廣譜抗體。 SIV感染恒河猴實(shí)驗(yàn)顯示了類似結(jié)果，N160和N332依賴的抗體普遍在恒河猴個(gè)體中出現(xiàn)，提示識(shí)別糖的中和抗體在自然感染時(shí)容易產(chǎn)生，可作為疫苗靶點(diǎn)[33]?？贵w進(jìn)化與病毒逃逸的相互關(guān)系顯示，患者時(shí)序性血清對(duì)不同亞型病毒的中和能力呈現(xiàn)出3個(gè)波段：①最初抗體識(shí)別N167，病毒發(fā)生N167D部分逃逸，抗體進(jìn)化產(chǎn)生針對(duì)N160的抗體，產(chǎn)生交叉活性，形成第1個(gè)波峰；②病毒部分逃逸，發(fā)生N160突變，但這是短暫的逃逸，因?yàn)镹160突變暴露了其他中和位點(diǎn)，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生第2個(gè)波峰，通過病毒突變逃逸實(shí)驗(yàn)推測(cè)這時(shí)抗體識(shí)別依賴糖的 CD4bs，類似HJ16；③病毒在T278A/N279D和R456W后又產(chǎn)生了針對(duì)第2波峰的血清逃逸。CAP257患者體內(nèi)出現(xiàn)PG9抗體后，出現(xiàn)了類HJ16抗體，且在其他有多類中和抗體的患者血清中均能分離到針對(duì)V2和CD4bs的抗體。如果利用幾個(gè)逃逸的病毒膜蛋白作為疫苗順序免疫，有可能免疫出類似CAP257患者的幾個(gè)血清波峰，產(chǎn)生針對(duì)多處的多類抗體，協(xié)同保護(hù)機(jī)體，防止HIV-1感染。

綜上所述，先進(jìn)技術(shù)的使用促進(jìn)了高效廣譜中和抗體的分離、表位結(jié)構(gòu)的鑒定和對(duì)中和抗體發(fā)生過程的重現(xiàn)。通過“精英患者”深入了解HIV-1與免疫系統(tǒng)的相互作用過程，研究人員提出了一些疫苗設(shè)計(jì)策略：①將廣譜中和抗體的初始B細(xì)胞作為靶點(diǎn)，特定誘導(dǎo)這些有潛力的B細(xì)胞分化、增殖，定向誘導(dǎo)為廣譜中和單克隆抗體；②選擇不同時(shí)間點(diǎn)“精英患者”的病毒序列順序免疫，重現(xiàn)逃逸與抗體進(jìn)化過程，誘導(dǎo)產(chǎn)生多類中和抗體，產(chǎn)生協(xié)同保護(hù)作用；③采用反向疫苗設(shè)計(jì)思路，主動(dòng)設(shè)計(jì)并改造膜蛋白形式，將HIV-1廣譜中和抗體的關(guān)鍵表位轉(zhuǎn)化為高效的HIV-1疫苗，這將是未來(lái)研究的主要方向。但是，哪種疫苗策略能真正在人體中誘導(dǎo)保護(hù)性廣譜中和抗體，還需進(jìn)一步探索。我們堅(jiān)信，隨著對(duì)HIV表面蛋白和廣譜中和抗體結(jié)構(gòu)及功能的深入研究，一定能在不遠(yuǎn)的將來(lái)成功研發(fā)出有效的艾滋病疫苗，為人類的健康事業(yè)作出貢獻(xiàn)。

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