東垣益氣膏預(yù)防性給藥對肺氣虛證大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶表達的影響

趙靜 李庭凱 胡蘭貴 魏錦萍

[摘要] 目的 觀察東垣益氣膏對MMP-2和MMP-9在肺氣虛證大鼠模型支氣管和肺組織中的表達的影響。 方法 將50只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、玉屏風組、東垣益氣膏低/高劑量組共5組，每組10只。采用煙熏造模法建立肺氣虛證大鼠模型，造模同時開始灌胃東垣益氣膏，連續(xù)60 d。采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物方法檢測支氣管肺組織中MMP-2和MMP-9的表達。 結(jié)果 與對照組比較，模型組MMP-9、MMP-2在支氣管肺組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；給藥后與模型組比較，高劑量組和玉屏風組MMP-9、MMP-2表達顯著減少，其中高劑量組優(yōu)于玉屏風組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 結(jié)論 東垣益氣膏可抑制支氣管肺組織中MMP-9、MMP-2的表達，在一定程度上阻止肺氣虛證模型的形成。

[關(guān)鍵詞]東垣益氣膏；肺氣虛證；基質(zhì)金屬蛋白酶

[中圖分類號] R287???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2012）21-28-04

Dongyuan Yiqi ointment in lung-qi card rats matrix metalloproteinases express influence

ZHAO?Jing1??LI?Tingkai1??HU?Langui1??WEI?Jinping2

1.Shanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030012， China；2.China Institute for Radiation Protection， Taiyuan 030006， China

[Abstract] Objective To observe the Dongyuan Yiqi ointment on matrix metalloproteinase 2 and MMP-9 in the lung-qi deficiency syndrome in a rat model of bronchial and pulmonary tissue expression influence. Methods 50 SD rats were randomly divided into control group， model group， Yupingfeng group， Dongyuan Yiqi ointment low and high dose group. A total of five groups，10 rats in each group. The smoked molding method establishment of pulmonary Qi deficiency syndrome in a rat model， modeling at the same time intragastric administration of Dongyuan Yiqi ointment and paste， for 60 days，using immunohistochemical staining method for detection of SABC in pulmonary tissue of MMP-2 and MMP-9 expression. Results Compared with the control group， model group， MMP-9， MMP-2 in bronchopulmonary tissue is highly expressed in （P<0.01）， high dose group， and Yupingfeng group MMP-9， MMP-2 expression decreased significantly （P<0.01）， wherein the high dose group is better than that of Yupingfeng group （P<0.01）. Conclusion The MMP-9， MMP-2 expression in pulmonary tissue can be inhibited by Dongyuan Yiqi ointment， to a certain extent， prevent formation of lung-qi deficiency syndrome model.

[Key words] Dongyuan Yiqi ointment； Lung-qi deficiency syndrome； Matrix metalloproteinase

肺氣虛證是肺的衛(wèi)氣、主氣功能減退為主的全身性疾病，常反復(fù)發(fā)作。肺氣虛證在人群中的發(fā)病率很高，主要罹患人群為中老年患者和兒童，需要從根本上改善患者體質(zhì)，以預(yù)防為主，防治結(jié)合，降低肺氣虛證的罹患率和復(fù)發(fā)率。東垣益氣膏是來自李東垣的清暑益氣湯加減，經(jīng)過加工熬制的中醫(yī)傳統(tǒng)劑型，是用于防治氣虛型外感的常用方劑。本實驗采用免疫組織化學染色鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）方法觀察東垣益氣膏預(yù)防性給藥對基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在肺氣虛證大鼠模型支氣管和肺組織中的表達的影響。

1?資料與方法

1.1?實驗動物來源

SD大鼠50只，雌雄各半，平均體質(zhì)量為（200±25）g。在山西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室動物室清潔級環(huán)境下飼養(yǎng)，動物合格證號SCXK（晉）2012-2。

1.2?藥物與試劑

東垣益氣膏是由山西省中醫(yī)院和平分院制成的浸膏，主要成分為：生黃芪15 g、炙甘草6 g、黨參10 g、當歸10 g、麥冬10 g、五味子10 g、青皮10 g、陳皮10 g、神曲10 g等。玉屏風顆粒（廣東環(huán)球制藥有限公司，批號99160）。多聚賴氨酸、一抗、光譜純試劑（SP）、二氨基聯(lián)苯胺（Dab），均購于河北博海生物工程開發(fā)有限公司。

1.3?主要儀器設(shè)備

顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51T-PHD-J11），多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics 公司，Image-Pro Plus），切片機（德國萊卡，RM2015），離心機（北京離心機廠，LDZ5-2型）。

1.4?實驗方法

1.4.1?模型制作?大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)l周后，除對照組外，模型組采用文獻[1] 的方法，將大鼠分批置入特制的1 m3的煙室中， 用鋸末50 g加10支紅山茶牌香煙混合點燃煙熏，熏煙 30 min/次， 2次/d；自由進食、飲水，適當通風，以防大鼠窒息。每天觀察并記錄其癥狀體征變化，60 d完成造模。

1.4.2?分組與給藥?將大鼠隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。（1）對照組：置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)，不予處理。（2）模型組：造模開始時以20 mL/（kg·d）灌服無菌水1次/d。（3）陽性對照組：造模開始時予玉屏風顆粒水溶劑5 g/（kg·d）。（4）東垣益氣膏低劑量組：造模開始時予東垣益氣膏水溶劑灌胃 5 g/（kg·d），相當于成人常規(guī)臨床用量7倍。（5）東垣益氣膏高劑量組：造模開始時予東垣益氣膏水溶劑灌胃 10 g/（kg·d），相當于成人常規(guī)臨床用量的14倍。

1.5?取材及觀察指標

1.5.1?癥狀與體征?觀察各組大鼠的活動度、對外界反應(yīng)的靈敏度、攝食、體重、毛發(fā)色澤的變化。

1.5.2?MMP-2和MMP-9表達的檢測?取每只大鼠的右肺下葉及氣管，按照免疫組織化學染色SABC方法，用磷酸鹽緩沖液沖洗、4%多聚甲醛進行脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，將厚度5 μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜，脫蠟、入水。用正常山羊血清替代一抗作陰性對照。MMP-2和MMP-9的陽性表達以光學顯微鏡下見細胞質(zhì)中出現(xiàn)明確的棕黃色顆粒的細胞為標準。結(jié)果采用多功能真彩色細胞圖象分析管理系（美國Media Cybernetics公司）對MMP-2和 MMP-9的表達進行圖像分析，表達結(jié)果用陽性面積和平均光密度表示。

1.6?統(tǒng)計學處理

采用 SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用（）表示， 各組間比較用t 檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?癥狀與體征

對照組活潑好動，體形肥胖，毛發(fā)光澤，呼吸平穩(wěn)。模型組大鼠先后出現(xiàn)精神萎靡， 行動遲緩； 體重增幅減小，食量減少；毛發(fā)色黃、無光澤易脫落；呼吸加深急促，咳嗽頻作，偶有呼吸道分泌物流出。給藥組表現(xiàn)介于空白組、模型組之間。

2.2?MMP-2在支氣管、肺組織中的表達

對照組大鼠支氣管和肺組織中MMP-2少量陽性表達（圖1），模型組支氣管和肺組織MMP-2陽性表達明顯多于對照組（圖2），玉屏風組、東垣益氣膏高劑量組支氣管和肺組織MMP-2陽性表達減少（圖3～5）。陰性對照組大鼠支氣管、肺組織中MMP-2不表達。其中東垣益氣膏高劑量組優(yōu)于玉屏風組。各組大鼠支氣管、肺組織中MMP-2的平均光密度和陽性面積見表1。

2.3?MMP-9在支氣管、肺組織中的表達

對照組大鼠支氣管和肺組織中MMP-9少量陽性表達（圖6），模型組支氣管和肺組織MMP-9達明顯多于對照組（圖7），玉屏風組、東垣益氣膏高劑量組支氣管和肺組織MMP-9表達減少（圖8～10）。陰性對照組大鼠支氣管、肺組織中MMP-9表達。其中東垣益氣膏高劑量組優(yōu)于玉屏風組。各組大鼠支氣管、肺組織中MMP-9 的平均光密度和陽性面積見表1。

3?討論

基質(zhì)金屬蛋白酶家族是一類活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，能降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），以酶原形式分泌，主要參與組織重建、修復(fù)等[2]。ECM 包括纖維性成分、連接蛋白和間質(zhì)成分，主要為糖胺聚糖等，對細胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。合成這些蛋白質(zhì)的 ECM 代謝酶可分為基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）[3]。MMP-2和MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶中兩類具有基質(zhì)分解活性的酶類，主要水解變性膠原及基膜的主要成分IV型膠原。在正常情況下，構(gòu)成肺泡壁的ECM的降解與合成處于動態(tài)平衡，以保持正常的肺組織結(jié)構(gòu)和肺功能，蛋白酶分泌增加和/或抗蛋白酶減少均可致ECM 受損[4]。正常肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶主要參與肺基質(zhì)的更新、損傷愈合等，從而使肺基質(zhì)能夠維持氣道和肺泡結(jié)構(gòu)的完整，以維持正常的肺功能。本實驗造模采用煙熏法，在煙霧的不斷刺激下，呼吸道單核巨噬細胞系統(tǒng)被激活，使氣道中肺泡巨噬細胞（AM）、嗜中性粒細胞（PMN）等炎性細胞增加，導致MMP-2和MMP-9 在AM 等炎性細胞和部分肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞、成纖維細胞中大量合成與分泌[5]。MMP-2和MMP-9大量產(chǎn)生產(chǎn)生和釋放后，對肺泡壁的ECM 進行破壞，同時炎癥細胞在氣道壁、氣道腔和肺泡腔中聚集，形成惡性循環(huán)，進一步加重了局部的炎癥反應(yīng)，促進了肺氣虛證的發(fā)生發(fā)展。

肺氣虛證為肺系病的常見證候，目前對于肺氣虛證的治療研究，多是患病后的治療，因本證屬虛證，易于反復(fù)發(fā)作，所以單純的治療，往往預(yù)后不理想，而且日久易變生其他疾病，因此必須重視早期積極干預(yù)和治療，未病先防。本研究中所用的清暑益氣湯是山西省中醫(yī)藥研究院已故名老中醫(yī)朱進忠用于防治氣虛型外感的常用方劑，療效甚佳。本方源于李東垣《脾胃論》，由人參、黃芪、當歸、白術(shù)、甘草、升麻、葛根、澤瀉、神曲、蒼術(shù)、麥冬、五味子等藥物組成。方取黨參、黃芪、白術(shù)、麥冬、五味子、甘草益氣生津，以扶元氣；黃柏、蒼術(shù)、神曲清熱燥濕、消食導滯，以祛病邪；升麻、葛根、澤瀉以升清降濁；當歸、青陳皮以調(diào)暢氣血；生姜、大棗以調(diào)和管衛(wèi)。聚益氣升陽、清熱生津、斂陰止汗、健脾燥濕、理氣和胃之功效于一體[6]。膏方作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分之一， 最大的優(yōu)勢是根據(jù)中醫(yī)的基本理論，運用“治未病”的理念，通過“固本、治本”全面防范疾病發(fā)生，提高生存質(zhì)量[7]。用于臨床兼顧面廣，口感好，不傷脾胃，適宜久服，簡單方便，是臨床的一種個性化的防治疾病的手段[8]，將本方制備成膏用于肺氣虛證的防治能很好地體現(xiàn) “治未病”的思想。本實驗結(jié)果表明模型組MMP-2和MMP-9表達較對照組明顯增強，提示肺氣虛證與MMP-2和MMP-9 的表達增加有關(guān)。玉屏風組、東垣益氣膏高劑量組MMP-2 和MMP-9表達較模型組明顯減少，其中高劑量組優(yōu)于玉屏風組。提示東垣益氣膏預(yù)防性給藥能明顯抑制肺氣虛證大鼠MMP-2和MMP-9的表達，干預(yù)氣道重構(gòu)，在一定程度上阻止肺氣虛證模型的形成。這可能是東垣益氣膏能有效地干擾“肺氣虛證”模型形成的機制之一。

[參考文獻]

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[3] 趙敏，陳忻怕，陳振發(fā).清肺化痰通絡(luò)方對肺纖維化大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2012，9（15）：14-16.

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[8] 王珺，張婉，陳浩林，等.探討傳統(tǒng)膏方在 “治未病”中的臨床體現(xiàn)[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）：3100-3101.

（收稿日期：2012-08-09）