ZBTB5基因真核表達質粒的構建及其在HEK 293T細胞中的表達

姜玉新

(皖南醫(yī)學院生理學教研室，安徽 蕪湖 241002)

BTB(bric-à-brac, tramtrack, and broad)[1]或POZ(Pox virus and zinc finger[2])結構域是一個進化保守的蛋白-蛋白互作結構域，存在于許多調節(jié)蛋白[2-3]。人類中有184個已知蛋白含BTB結構域[4]。BTB結構域蛋白與許多關鍵的細胞進程有關，如凋亡[5]、發(fā)育[6-8]、離子通道活性[9]、腫瘤發(fā)生[10-11]、轉錄[11-12]和蛋白降解[13-14]。本實驗室前期克隆了一個含BTB結構域的基因ZBTB5，并認為其可能在腫瘤發(fā)生以及生殖發(fā)育中具有重要的作用[15]，隨后，Koh DI等[4]發(fā)現該基因可能是一個細胞周期中的轉錄抑制子和刺激細胞增殖的原癌基因。其結果與我們預期的類似。本研究擬擴增ZBTB5基因完整編碼區(qū), 構建其真核表達載體，并在真核細胞內表達，為今后進一步深入研究該基因的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1菌株、細胞和質粒 大腸桿菌DH5α感受態(tài)、HEK293T細胞、pET-28a(+)-ZBTB5、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-GFP載體均為本實驗室保存。

1.2試劑 DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、質粒提取及DNA電泳凝膠回收試劑盒、兔抗GFP一抗(SKG09)、DNA和蛋白marker、BCA蛋白測定試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；HRP標記的羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；引物合成和DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；Mouse anti beta-actin(A00702)購自南京金斯瑞生物科技有限公司；DMEM及胎牛血清購自Gibco公司；HRP-Donkey anti mouse IgG(H+L)(SA00001-8)購自武漢三鷹生物技術有限公司；DNAfect Transfection Reagent(CW0860)購自北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3基因擴增 根據GenBank公布的ZBTB5基因(NM_014872.2)設計特異性引物ZBTB5F(5-CGCGGA TCCATG GAT TTT CCT GGT CAC TTT GA-3，劃線部分為BamHⅠ位點)和ZBTB5R(5-TACCTC GAGTCA CTA GAG CAA AGT GCT GGG AAG-3，劃線部分為XhoⅠ位點)。以pET-28(a)-ZBTB5質粒為模板進行PCR擴增，獲得全長編碼序列。PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后，在紫外燈下觀察結果。

1.4pcDNA3.1-ZBTB5-GFP重組表達載體的構建 將pcDNA3.1-GFP載體和ZBTB5基因的PCR產物用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收純化產物。回收產物摩爾比按1:8(載體:片段)的比例，利用T4DNA連接酶4℃連接過夜，取5 μl連接產物轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂于LB/Amp+平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落，接種于含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。用堿裂解法提取質粒DNA，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，質粒DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

1.5細胞轉染及觀察 胰酶消化HEK 293T細胞，1200 g離心3 min收集細胞，用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，鋪于6孔板(2 ml/孔)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)至細胞融合度達80%～90%，按照DNAfect Transfection Reagent轉染進行轉染，操作按說明書進行。46 h后，光鏡和OLYMPUS熒光顯微鏡(488 nm激發(fā))下分別觀察細胞并拍照。

1.6蛋白質提取與Western blot鑒定 轉染46 h后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次。胰酶消化細胞，1200 g離心3 min收集細胞，加入0.1 ml Lysis buffer、1 μl蛋白酶抑制劑、1 μl PMSF。將細胞和裂解液轉入1.5 ml離心管中，冰上放置10 min。13 000 g、4℃離心5 min，上清轉到新的離心管中。用BCA蛋白測定試劑盒和BSA標準品測定上清中的蛋白濃度，操作步驟按說明書進行。

將蛋白定量后，取80 μg總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠分離，150 mA 3 h轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。用Rabbit anti GFP(1∶500稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(1∶5 000稀釋)二抗37℃孵育40 min，TBST洗膜3 次，每次10 min。ECL曝光1 min。內參抗體Mouse anti beta-actin(1∶1 000稀釋)37℃緩慢振蕩1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。HRP-Donkey anti mouse IgG(1∶5 000稀釋)二抗37℃孵育40 min，TBST洗膜3 次，每次10 min。ECL曝光20 s。

2 結 果

2.1重組表達載體的鑒定 將重組質粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示：其酶切產物獲得的目的基因條帶約為2 Kb左右(圖1)，表明重組質粒構建成功。經測序分析及NCBI-BLAST比對結果與ZBTB5基因編碼序列一致。

圖1 重組質粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP的酶切分析

2.2報告基因GFP表達的檢測 為進一步確定重組表達載體pcDNA3.1-ZBTB5-GFP是否在真核細胞中表達，我們將重組載體轉染HEK 293T細胞，并用熒光顯微鏡觀察報告基因GFP的表達情況。結果表明：用pcDNA3.1-ZBTB5-GFP轉染HEK 293T細胞后，可檢測到GFP，但與pcDNA3.1-GFP轉染的細胞相比，pcDNA3.1-ZBTB5-GFP的表達明顯降低，而pcDNA3.1空載體對照組未見GFP表達。光鏡下可見轉染pcDNA3.1-ZBTB5-GFP后，細胞形態(tài)正常，與pcDNA3.1空載體對照組和pcDNA3.1-GFP對照組無差異(圖2)。

圖2 報告基因GFP在HEK 293細胞中的表達檢測

2.3ZBTB5蛋白的Western blot檢測 為確定ZBTB5蛋白是否也在HEK 293T細胞中表達，我們以GFP為一抗應用Western blot對其檢測，結果表明：pcDNA3.1空載體對照組未出現條帶，pcDNA3.1-GFP對照組僅出現GFP蛋白條帶，而pcDNA3.1-ZBTB5-GFP實驗組除了出現GFP條帶外，還有一條融合蛋白(ZBTB5+GFP)條帶，這說明ZBTB5蛋白亦成功在細胞中表達(圖3)。

圖3 ZBTB5表達的Western blot檢測

3 討 論

人類基因組中預測有數百個BTB/POZ蛋白(http://btb.uhnl.es.utomnto.ca/db_stats.php)，但功能已知的較少，且在表達調控、細胞分化、發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。如PLZF(Promyelocytic Leukemia Zinc Finger protein，或ZBTB16)參與了細胞凋亡、造血細胞的發(fā)育與分化、骨骼與神經的發(fā)育等生物學功能[16-18]；BCL-6(B-Cell Lymphoma 6，或LAZ3、BCL-5)參與了細胞凋亡、B細胞發(fā)育分化、抗炎等[19-21]。我們前期的研究[15]發(fā)現，ZBTB5蛋白可能是一個轉錄因子，可能在腫瘤發(fā)生以及生殖發(fā)育中具有重要的生物學功能。后來，Koh DI等[4]發(fā)現其參與了細胞周期調控。這說明ZBTB5也是一個非常重要的轉錄因子。從以往研究含BTB結構域蛋白的功能發(fā)現，每個BTB蛋白的功能具有多樣性，ZBTB5也不例外，如染色體易位導致ZBTB5的第二外顯子插入了外源片段，從而導致淋巴瘤[22]。因此深入研究該蛋白的生物學功能，有助于全面揭示其生物學本質，從而為其能否作為因其功能異常所致的疾病的治療靶點奠定基礎。

構建真核表達載體將目的基因轉染到宿主細胞內，使其在宿主細胞中持續(xù)表達是基因治療最具應用前景的方法。真核表達載體pcDNA3.1因其5’端含CMV啟動子、3’端polyA尾，可高效表達外源目的基因而被廣泛應用；同時綠熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)因其性質穩(wěn)定、不影響外源基因的表達及生物學活性，并可對外源基因的表達進行追蹤，從而有利于篩選外源基因和GFP共表達的陽性細胞株[23]。本研究克隆了ZBTB5全長編碼基因，并將其插入到pcDNA3.1-GFP載體中，經雙酶切及測序鑒定，成功獲得了重組質粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP。將該重組載體對HEK 293T細胞株轉染后，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達發(fā)現，pcDNA3.1-ZBTB5-GFP實驗組中GFP的表達明顯下降，但光鏡下的細胞數量未發(fā)生改變。其可能的原因是ZBTB5干擾了GFP的表達，從而導致其表達下降，但其具體機制有待于進一步的研究。Western blot發(fā)現ZBTB5在細胞中成功表達，為其未來可能用于基因治療奠定基礎。

總之，本實驗成功構建了真核表達載體pcDNA3.1-ZBTB5-GFP，并將其轉染至HEK 293T細胞株，熒光顯微鏡下觀察到該融合質粒能成功在細胞中表達。我們將進一步探討其導致GFP表達下降的機制，為ZBTB5其他的生物學功能揭開其面紗。

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