人巨細(xì)胞病毒病毒體的組裝研究新進(jìn)展

毛有勝，賈淑芳，計(jì)曉，李增，王明麗

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，合肥230032； 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥230032

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是引起人類(lèi)廣泛感染的重要病原體，具有致死性，且可引起終身感染，包括在潛伏感染的細(xì)胞與終身持續(xù)間斷性感染的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的感染。HCMV可感染多種類(lèi)型細(xì)胞，并于多種器官中檢測(cè)到。其在人群中感染率較高，致病率較低，但對(duì)免疫力低下者、新生兒及老年人影響較大[1]。HCMV先天性感染會(huì)導(dǎo)致新生兒耳聾和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等，同時(shí)也是導(dǎo)致艾滋病患者視網(wǎng)膜炎和失明的重要原因。在器官移植患者和使用免疫抑制劑的癌癥患者中，HCMV感染有較高的發(fā)病率。HCMV感染還導(dǎo)致某些炎性、增生性疾病，心血管疾病，以及特定癌癥[2]。HCMV原發(fā)感染和再發(fā)感染都可引起HCMV病。但目前還沒(méi)有針對(duì)其感染的有效疫苗，僅有的幾種具有治療性的藥物有生物利用度低、毒性高及易形成耐藥株等問(wèn)題。因此，弄清HCMV的結(jié)構(gòu)及其組裝機(jī)制對(duì)相應(yīng)疫苗及抗病毒藥物的研制具有重要意義，可為HCMV相關(guān)疾病的有效預(yù)防和積極治療帶來(lái)新的思路。

HCMV為β皰疹病毒亞科成員之一，具有特征性的皰疹病毒結(jié)構(gòu)和基因級(jí)聯(lián)表達(dá)。病毒體(圖1)由含有235 kb線狀雙鏈DNA(為皰疹病毒中最大的)的核衣殼及外層蛋白為主的被膜(tegument)和脂質(zhì)為主的包膜(envelope)組成[3]。病毒體直徑約230 nm，衣殼直徑約110 nm，為二十面體立體對(duì)稱(chēng)型。病毒DNA含約250個(gè)開(kāi)放讀碼框架(open reading fragment，ORF)，編碼大量蛋白質(zhì)。衣殼包含4種必需蛋白成分：次要衣殼蛋白結(jié)合蛋白(minor capsid protein-binding protein, mCBP, pUL46)、裝配蛋白前體(assembly protein precursor, pAP,pUL80.5)、次要衣殼蛋白(minor capsid protein, mCP, pUL85)、出口蛋白(portal protein，pUL104)。它們形成162個(gè)殼微粒和320個(gè)殼微粒間的異源三聚體，其中殼微粒包括150個(gè)六聚體和12個(gè)五聚體，而出口蛋白占據(jù)1個(gè)五聚體的位置，形成1個(gè)頂點(diǎn)[4]。被膜厚度約為50 nm，由眾多被膜蛋白組成，如pp65(pUL83)、pp28(pUL99)、pp150(pUL32)、pp71、pUL47、pUL48和pUL97，大部分蛋白已被磷酸化。被膜蛋白分為2類(lèi)，內(nèi)側(cè)被膜蛋白緊密結(jié)合在衣殼上，外側(cè)被膜蛋白則相對(duì)疏松分布于衣殼與包膜之間。最外層富含脂質(zhì)的包膜厚度約10 nm，其上嵌有包膜蛋白。病毒體中除自身編碼的蛋白外，還含有部分宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)，可檢測(cè)到細(xì)胞RNA[5]。病毒按時(shí)間順序可先后表達(dá)3類(lèi)蛋白：即刻早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白。在病毒潛伏感染期，后兩者表達(dá)受抑制，基因表達(dá)也最小化以逃避免疫監(jiān)視，不產(chǎn)生子代病毒。潛伏感染的再激活會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生及病毒傳播。病毒編碼的各種蛋白質(zhì)功能有待進(jìn)一步研究，同時(shí)病毒體中所含有的宿主蛋白及RNA對(duì)病毒的影響也引起了人們的重視，可用分子生物學(xué)方法檢測(cè)或電子顯微鏡觀察其對(duì)病毒增殖過(guò)程的影響。

A series of proteins and DNA transport into nucleus, and form three kinds of related capsids. A-capsids are shells composed of the four integral proteins and have the simplest structure. B-capsids contain all of the A-capsid proteins and several additional internal scaffold proteins (UL80). C-capsids are from the cytoplasmic fraction of infected cells treated with NP-40 and are composed of the DNA genome within an A-capsid shell containing some tightly adherent tegument proteins (e.g., pUL32, pUL47, pUL48).

圖1HCMV核衣殼形成的模式圖

Fig.1Capsidassemblymodel

被病毒感染的細(xì)胞中除存在具有感染性的病毒體外，還有另外2種非感染性病毒顆粒：非感染性包膜顆粒(noninfectious enveloped particle，NIEP)和致密體( dense body，DB)顆粒。NIEP數(shù)量極少，與病毒體的區(qū)別在于無(wú)病毒DNA。DB顆粒由大量被膜蛋白pp65和少量其他蛋白、RNA及外面包繞的包膜構(gòu)成。

本文僅從核衣殼的形成開(kāi)始，將近年來(lái)HCMV組裝的研究新進(jìn)展作一綜述。

1 核衣殼的形成

HCMV核衣殼的形成如圖1所示，要經(jīng)歷pAP-蛋白酶前體(protease precusor, pPR)-主要衣殼蛋白(major capsid protein, MCP)復(fù)合物形成、殼微粒前體形成、異源三聚體形成、入核、原始衣殼形成和衣殼成熟。

pAP-pPR-MCP復(fù)合物的形成：該組裝起始于細(xì)胞質(zhì)中。首先由氨基端保守結(jié)構(gòu)域(amino conserved domain,ACD)促進(jìn)pAP相互結(jié)合，這又促進(jìn)其通過(guò)羧基端(C端)保守結(jié)構(gòu)域(carboxyl conserved domain,CCD)與MCP(pUL86)結(jié)合。這種結(jié)合使缺少核定位序列(nuclear localization signal，NLS)的MCP借助pAP-MCP復(fù)合體上pAP的2個(gè)NLS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。ACD的生物學(xué)作用是通過(guò)研究突變病毒株發(fā)現(xiàn)的，突變株病毒復(fù)制減緩，組裝衣殼的效率下降，比野生型毒株慢約20倍[6]。同樣，NLS的生物學(xué)作用也是通過(guò)突變株發(fā)現(xiàn)的，NLS1/NLS2雙突變對(duì)病毒來(lái)說(shuō)是致命的，失去其中一個(gè)即可降低MCP的入核效率，失去NLS2對(duì)病毒的影響更大[7]。因?yàn)閜PR具有與pAP相同的C端，故其能通過(guò)ACD與pAP相連，通過(guò)CCD與MCP相連，使pPR進(jìn)入衣殼腔并獲得酶的功能,有酶活性的pPR在衣殼形成后期剪切原始衣殼上的蛋白肽鏈，使它們從原始衣殼上脫落并進(jìn)一步排出。入核前在胞質(zhì)中會(huì)形成3種最基本、最簡(jiǎn)單的復(fù)合物：pAP-MCP、pAP-pPR-MCP和pPR-MCP。其中pAP-pPR-MCP的結(jié)構(gòu)模式如圖2所示。

The amino conserved domain (ACD), which promotes self-interaction of pAP and pPR; the carboxyl conserved domain (CCD), which promotes (continued) interaction of pAP and pPR with MCP; nuclear localization signals 1 and 2 (NLS1, NLS2); mitogen-activated protein kinase (MAPK) and glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) sites whose phosphorylation antagonizes self-interaction of pAP; and the five pPR self-cleavage sites: M-site，R-site，I-site, C-site, and T-site.

圖2pAP-pPR-MCP的結(jié)構(gòu)模式圖

Fig.2ThemodelofpAP-pPR-MCP

殼微粒前體形成：以上述3種復(fù)合物為基礎(chǔ)，繼續(xù)結(jié)合形成更大的復(fù)合物，其為一個(gè)較大的多聚體，稱(chēng)殼微粒前體。

mCP、mCBP形成三聚體：在細(xì)胞質(zhì)中，mCP雖足夠小，能完全通過(guò)擴(kuò)散穿過(guò)膜，但不能進(jìn)入胞核，因其缺少NLS。同樣，存在于胞質(zhì)中具有NLS的蛋白mCBP也不能單獨(dú)進(jìn)入細(xì)胞核。當(dāng)它們同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)集聚時(shí)，可形成異源三聚體，以此形式方能共同進(jìn)入胞核。

入核：殼微粒前體與上述異源三聚體在NLS的幫助下進(jìn)入核內(nèi)，出口蛋白也進(jìn)入核，在自身NLS作用下不需要其他病毒蛋白的協(xié)助[4]。

原始衣殼形成： 殼微粒前體結(jié)合異源三聚體及出口蛋白形成原始蛋白衣殼。原始衣殼沒(méi)有棱角,不含病毒DNA,有出口蛋白，需進(jìn)一步剪切。研究表明，出口蛋白形成出口蛋白復(fù)合物不需任何其他病毒蛋白的協(xié)助[4]。出口蛋白復(fù)合物包括冠部、翼部和柄部[4]。

衣殼成熟：此時(shí)的衣殼需進(jìn)一步成熟，經(jīng)自身剪切作用將部分蛋白肽鏈從原始衣殼上剪切下來(lái)，剪切位點(diǎn)在pAP及pPR上(圖2)。斷裂位點(diǎn)及順序是：在pPR作用下，R、M位點(diǎn)先斷裂；在次晶蛋白作用下，I、C位點(diǎn)后斷裂[8]。ACD也在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此過(guò)程中，衣殼形態(tài)發(fā)生相應(yīng)變化，產(chǎn)生棱角。

核衣殼形成(剪切脫落物排出與DNA進(jìn)入)：這兩個(gè)過(guò)程幾乎同時(shí)進(jìn)行。隨著DNA進(jìn)入衣殼的量增多，衣殼中剪切脫落物所占比例逐漸下降。DNA進(jìn)入促進(jìn)剪切產(chǎn)物排出，同時(shí)剪切產(chǎn)物磷酸化減弱它們之間的連接，也促使剪切產(chǎn)物排出[9]。DNA進(jìn)入衣殼需末端酶-出口蛋白復(fù)合體的幫助[10]，而pUL7則在衣殼內(nèi)對(duì)DNA起穩(wěn)定作用。

2 被膜與包膜的形成

HCMV被膜與包膜形成是密不可分、同時(shí)進(jìn)行的。研究表明，被膜與包膜形成、病毒出核及出細(xì)胞密切相關(guān)。在病毒顆粒出核、出細(xì)胞過(guò)程中，經(jīng)歷包膜形成與去除及包膜二次形成。第2次包膜形成也是最終包膜伴隨病毒出細(xì)胞膜的過(guò)程。圖3概括了被膜與包膜的形成過(guò)程。這種機(jī)制是非選擇性的，不僅可形成病毒體，還可能形成無(wú)病毒DNA的NIEP，以及包膜包裹大量被膜蛋白pp65、少量其他蛋白和RNA形成的致密體顆粒。當(dāng)病毒的某些被膜蛋白突變或缺失時(shí)，可導(dǎo)致NIEP和DB顆粒形成增加[11]。

Tegument and envelop migrate out of the nucleus. This mechanism is not selective for DNA-containing particles. At least three distinct parallel processes contribute to the final virion membrane.

圖3HCMV被膜與包膜形成過(guò)程示意圖

Fig.3Modeloftegumentationandenvelopment

包膜的初次形成發(fā)生在核內(nèi)膜處，這有助于病毒顆粒穿過(guò)核內(nèi)膜進(jìn)入核周間隙?，F(xiàn)已知皰疹病毒此過(guò)程需2組保守蛋白質(zhì)，在HCMV為pUL50和pUL53，它們之間相互結(jié)合可能啟動(dòng)包膜初次形成；HCMV M50/p35與細(xì)胞中蛋白激酶C結(jié)合，轉(zhuǎn)移到核膜處并發(fā)揮作用，使核纖層蛋白磷酸化，磷酸化后核膜與其下方的核纖層蛋白連接減弱，有利于病毒穿過(guò)核內(nèi)膜進(jìn)入核周間隙。接著可觀察到進(jìn)入核周間隙的病毒顆粒獲得包膜，但這只是暫時(shí)的。很快其與細(xì)胞核外膜融合，病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，失去初始包膜。

已有研究發(fā)現(xiàn)，被膜蛋白組裝可能在細(xì)胞核中就已開(kāi)始，但需在細(xì)胞質(zhì)中完成最后組裝。被膜蛋白的組裝過(guò)程及機(jī)制非常復(fù)雜，涉及病毒蛋白之間的相互作用和宿主細(xì)胞的參與。其中還有很多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

最后，核衣殼以出芽方式進(jìn)入胞質(zhì)小泡或小管，獲得最終包膜，形成組裝小室(組裝復(fù)合體)，并完成被膜蛋白組裝及成熟過(guò)程。這一過(guò)程由pUL71的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域啟動(dòng)[12]，并需pUL99參與，否則會(huì)造成具有被膜的核衣殼積聚在細(xì)胞質(zhì)中。在出芽形成包膜的過(guò)程中發(fā)生了一系列變化，如被膜蛋白凝集緊密、膜增厚等。這些變化發(fā)生在膜與衣殼密切接觸的地方，表明在包膜形成過(guò)程中這里發(fā)生了結(jié)構(gòu)和組分變化。

3 影響病毒體組裝的4個(gè)重要因素

3.1 組裝小室與包膜來(lái)源

組裝小室由修飾后的細(xì)胞分泌系統(tǒng)、內(nèi)體和高爾基復(fù)合體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)形成，而不是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體內(nèi)側(cè)及中間膜囊形成。這些分泌器官形成的小室組成需進(jìn)一步改造，以完成病毒體組裝成熟。組裝小室中包含各種病毒編碼的被膜蛋白、包膜蛋白和一些非結(jié)構(gòu)性蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，最終包膜來(lái)自于幾種不同的小囊泡，并最終形成一個(gè)膜。大囊泡的形成代表病毒體組裝的最終位置即組裝小室[13]。

已知組裝和成熟過(guò)程有較明確的3條平行途徑。①運(yùn)輸必需內(nèi)涵體分選復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基復(fù)合體形成的轉(zhuǎn)運(yùn)pUL99的小囊泡。Tandon等關(guān)于空泡蛋白分選蛋白4(vacuolar protein sorting 4，Vps4)和帶電荷多囊泡體蛋白1 (charged multivesicular body protein 1，CHMP1)的研究證實(shí)了這點(diǎn)[14]；②內(nèi)體(endosome)系統(tǒng)形成的轉(zhuǎn)運(yùn)gB的小囊泡；③ 由網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的非高爾基復(fù)合體源性小管轉(zhuǎn)運(yùn)pUL32。Cepeda等[15]的研究證實(shí)了前2條途徑。如果阻斷組裝小室的形成，或許可使病毒不能形成完整病毒體。

3.2 單個(gè)病毒體蛋白的影響作用

已有研究顯示，多種HCMV被膜蛋白及包膜蛋白如pp150(pUL32)、pp28(pUL99)、gO、gM/gN 等介導(dǎo)病毒在胞質(zhì)中的組裝與第2次包膜形成。pp150(pUL32)可能影響衣殼的穩(wěn)定性或引導(dǎo)衣殼在胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移；pUL96對(duì)pp150連接在核衣殼上起穩(wěn)定作用[16]；pp28(pUL99)可能協(xié)助包膜形成，它是被膜的重要組成成分，突變導(dǎo)致無(wú)包膜、無(wú)感染性的病毒顆粒積聚在胞質(zhì)中[17]。有研究還發(fā)現(xiàn)，pp28在組裝小體中形成多聚體對(duì)包膜形成至關(guān)重要[18]。pUL97影響病毒組裝小室的形態(tài)，并通過(guò)酶活性途徑影響組裝小室形成，通過(guò)非酶途徑加快病毒體形成與釋放[19]。不同被膜蛋白的重要性也有區(qū)別，有的是病毒所必需的，有的則影響病毒的增殖動(dòng)力學(xué)，如pUL25是非必需蛋白，可加速病毒體形成[20]；pUL71缺乏會(huì)導(dǎo)致包膜形成減緩及組裝過(guò)程中小囊泡擴(kuò)大。Jiang等[21]也證明，pUL74能促進(jìn)最終包膜形成。有研究提示，病毒的某些單個(gè)被膜蛋白缺失可導(dǎo)致整個(gè)病毒構(gòu)成發(fā)生變化[22]。各病毒體不同蛋白的ORF缺失會(huì)導(dǎo)致病毒體不能形成，形成突變病毒體和發(fā)生重要的病毒增殖缺陷(分別用“E”、“NE”、“D”表示，詳見(jiàn)表1)，這反映了各蛋白的不同重要性[23]。

表1部分蛋白ORF缺失及其影響

Tab.1DeletionofORFs

EffectionCapsid proteinTegument proteinEnvelope proteinEUL46, UL48.5, UL80, UL85, UL86UL122, UL32, UL71, UL89.2, UL51,UL94, UL99, UL54, UL48C, UL48N, UL44 UL50, UL77NEUS24, UL45, UL25, US22, UL124, UL43DUL103, UL88, US23, UL26,UL47,UL112.1, UL35, UL72, UL82UL38, UL132

E, essential; NE, non-essential; D, defective growth.

3.3 具有重要意義的蛋白間結(jié)合

研究發(fā)現(xiàn),病毒蛋白間常相互連接在一起存在于宿主細(xì)胞中，這對(duì)病毒的組裝可能具有重要意義。目前認(rèn)為，病毒蛋白間存在4種結(jié)合：①衣殼蛋白間結(jié)合；②衣殼蛋白與被膜蛋白結(jié)合，可促進(jìn)被膜形成及獲得感染性；③被膜蛋白間結(jié)合，構(gòu)成被膜的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并在被膜修飾與形成中起重要作用；④被膜蛋白與包膜蛋白及包膜蛋白間結(jié)合，目前對(duì)其了解并不多。Phillips等[24]應(yīng)用酵母雙雜交分析法檢測(cè)任意2種被膜蛋白間可能存在的連接，同時(shí)To等[23]則應(yīng)用酵母雙雜交分析法和免疫共沉淀法檢測(cè)了更多蛋白(包括衣殼蛋白、被膜蛋白和包膜蛋白)間存在的連接，結(jié)果顯示這些蛋白間連接廣泛而復(fù)雜。這些復(fù)雜的相互連接網(wǎng)絡(luò)對(duì)病毒組裝成熟和出胞感染非常重要，如pUL69和pUL97進(jìn)入衣殼需pp65(pUL83)的存在[25]，pUL25也部分依賴(lài)與pp65結(jié)合而進(jìn)入病毒體[26]，pUL94與pUL99的結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)在組裝復(fù)合體中的定位具有重要意義[27,28]。弄清這些蛋白間的相互作用可對(duì)病毒的生物學(xué)組裝機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí)，并為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供新的思路與指導(dǎo)。

3.4 宿主細(xì)胞的參與

在HCMV感染細(xì)胞中,免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin binding protein，BiP)水平異常增高，在病毒組裝和成熟過(guò)程中起重要作用[29]。宿主細(xì)胞BiP缺失引起的表型與pp28突變體相似[30],提示BiP與pp28作用于病毒成熟的同一階段。有研究顯示，HCMV感染提高Rab27a表達(dá)水平，大量Rab27a募集在組裝小體的膜上；敲除Rab27a時(shí)，HCMV生成減少[31]。另外，電子顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜局部成分對(duì)最終包膜形成具有重要意義[32]。這些都反映了宿主細(xì)胞參與病毒組裝，進(jìn)一步弄清宿主與病毒間的相互作用對(duì)抗病毒藥物的研發(fā)具有重要意義。

后期的成熟過(guò)程尚有病毒相關(guān)激酶所致的蛋白磷酸化[33]、糖基化，以及被膜與包膜的改建等，使病毒體出殼并賦予其感染性。在高相對(duì)分子質(zhì)量的被膜蛋白pUL48氨基端發(fā)現(xiàn)了含半胱氨酸泛素蛋白酶活性[34]，表明其可能參與了后期成熟過(guò)程。

4 結(jié)語(yǔ)

HCMV的組裝可概括為兩大階段：一是入核階段，主要為核衣殼的組裝；二是出核階段，主要涉及被膜與包膜的組裝。還有很多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究，如原始衣殼內(nèi)剪切物排出的動(dòng)力及具體機(jī)制、被膜蛋白組裝具體機(jī)制、宿主細(xì)胞參與機(jī)制等。搞清楚HCMV的組裝過(guò)程可為病毒的生物學(xué)組裝機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí)，加深對(duì)病毒與宿主間關(guān)系的理解，為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供新的思路與指導(dǎo)，具有重要的基礎(chǔ)和臨床意義。

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