雌性肥胖大鼠皮下脂肪與內(nèi)臟脂肪Vaspin mRNA的變化

天津市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科 （天津300074） 商躍云 黃 樂 孫桂香 呂 玲 趙 彥

脂肪組織不僅是儲存和釋放能量的場所，而且是重要的內(nèi)分泌器官，可分泌多種脂肪細(xì)胞因子［1］。內(nèi)臟脂肪組織特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑（Visceral adipose tissue－erived serine protease inhibitor，Vaspin）是由脂肪組織分泌的脂肪細(xì)胞因子，有研究證實Vaspin水平與營養(yǎng)狀態(tài)、性別等有關(guān)［2］，高脂飲食誘發(fā)的雄性肥胖大鼠血與內(nèi)臟脂肪組織（睪周脂肪組織）Vaspin改變與胰島素敏感性減退有關(guān)［3］，但雌性大鼠內(nèi)臟脂肪組織與皮下脂肪組織（Subcutaneous adipose tissues，SAT）Vaspin改變的研究較少。本文旨在通過高脂飼料喂養(yǎng)雌性大鼠制造肥胖大鼠模型，對比血糖、胰島素、血脂及腎周脂肪組織（Perirenal adipose tissue，PAT）與SAT Vaspin的改變，為進(jìn)一步探討其在糖脂代謝和能量平衡調(diào)節(jié)中的作用及機(jī)制提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實驗材料

1．1 主要實驗儀器：紫外分光光度計：Smart SpecTM plus spectrophotometer，Bio－Rad，USA；電泳儀：PowerPac Basic，Bio－Rad，USA；凝膠成像系統(tǒng)：ChemiDocXRS，Bio－Rad USA；Real－time PCR 儀7500型：Applied Biosystems，USA。

1．2 主要試劑：Trizol：Invitrogen Technoloyies Ins，USA（批號：1158824）；DEPC：天津鼎天生物技術(shù)有限公司，Sigma分裝進(jìn)口（批號：D5758）；乙二胺四乙酸（EDTA）：Sigma公司（批號：083K5420）；dNTP：Fermentas（批號：9001）；Taq酶：Fermentas（批號：1005）；Oligo d（T）18：大連寶生物工程有限公司（批號：CT201C）；Ribonuclease inhibitor：大連寶生物工程有限公司（批號：CCA3901A）；DL2000DNA Marker：大連寶生物工程有限公司（批號：CC1502）；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV：Promega（批號：19847105）；引物合成：北京奧科生物工程公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）：Roche，Germany（批號：04 913 914 001）；普通飼料（大麥粉20%，玉米粉15%，花生粉10%，豆粉20%，魚粉10%，骨粉5%，酵母粉1%，麥麩15%，食鹽2%，混合礦物鹽1．5%，復(fù)合維生素0．5%）與高脂飼料（含普通飼料65．8%，添加豬油0．2%，蛋黃粉10%，蔗糖8%，酵母粉3%，混合礦物鹽1．5%，膽固醇1%，豬膽鹽0．2%，復(fù)合維生素0．5%）均由天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2．1 實驗動物的分組與模型建立：取SPF級斷乳雌性SD大鼠16只（購自天津市放射研究所動物實驗中心），隨機(jī)分成普通飲食組（A組）與高脂飲食組（B組），每組8只，分別給予普通飼料與高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周。

2．2 體格測量指標(biāo)：實驗開始時及連續(xù)喂養(yǎng)4周后均于禁食、水12h后測量體重（Weight，W）、體長（Height，H）及腹圍（Abdominal circumference，AC）。內(nèi)眥靜脈取血后斷頭處死，分離SAT與PAT迅速放入液氮，然后置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3 空腹血糖、胰島素及血脂測定：測量空腹血糖（FPG），胰島素（FINS）、血總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）與高密度脂蛋白（HDL）。FPG采取葡萄糖氧化酶法測定，F(xiàn)INS采用放射免疫法測定，血脂測定采用酶法。

2．4 SAT與PAT Vaspin mRNA水平的測定：采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real time polymerase chain reaction，Real－time PCR）法，主要操作步驟如下：采用Trizol法分別提取脂肪組織總RNA，紫外分光光度法對其定量，吸光度260／280比值判定純度，瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測完整性。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行Real－time PCR擴(kuò)增。內(nèi)參照肌動蛋白（β－actin）與目的片段Vaspin的引物應(yīng)用軟件Gene Runner、并根據(jù)GenBank所發(fā)布的目的基因序列自行設(shè)計，同時經(jīng)NCBI BLAST檢索無顯著同源性。具體引物序列和擴(kuò)增片段長度，見表1。

表1 Real－time PCR 引物序列

Real－time PCR反應(yīng)體系參照SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒說明書。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸34s，進(jìn)行40個循環(huán)。溫度變化速度為3℃／s，在每個循環(huán)延伸階段檢測熒光信號，進(jìn)行實時監(jiān)控，最后進(jìn)入解鏈階段，繪制產(chǎn)物的融解曲線，以了解樣品擴(kuò)增的特異性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。數(shù)據(jù)的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成。每管樣品重復(fù)測定4次。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 實驗開始時兩組大鼠體格測量參數(shù)比較：兩組大鼠 W、H及AC差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），具有可比性，見表2。

表2 實驗開始時兩組大鼠體格測量參數(shù)比較（±s，n＝8）

表2 實驗開始時兩組大鼠體格測量參數(shù)比較（±s，n＝8）

注：與A組比較，＊P＞0．05

組別 W（g） H（cm） AC（cm）A組77．88±10．67 11．13±0．88 7．17±0．86 B組 77．38±11．21＊ 10．94±0．94＊ 7．23±0．80＊

2 喂養(yǎng)4周后兩組大鼠體格測量參數(shù)比較：兩組大鼠 W、H及AC差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），且B組大鼠體重均超過A組大鼠平均體重20%，實驗肥胖大鼠造模成功，見表3。

表3 喂養(yǎng)4周后兩組大鼠體格測量參數(shù)比較 （±s，n＝8）

表3 喂養(yǎng)4周后兩組大鼠體格測量參數(shù)比較 （±s，n＝8）

注：與 A組比較，＊P＜0．05，△P＜0．01

組別 W（g） H（cm） AC（cm）A 組 155．75±21．34 15．75±1．75 12．33±1．73 B組 192．88±35．86＊ 18．88±1．64＊ 14．75±0．89△

3 兩組大鼠血FPG、FINS、血脂及SAT與PAT Vaspin mRNA相對表達(dá)水平測定結(jié)果：兩組大鼠FPG、FINS、TC、TG、LDL、HDL及PAT Vaspin mRNA相對表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），B組大鼠 FPG、FINS、TC、TG、LDL 及 PAT Vaspin mRNA相對表達(dá)水平均高于A組，HDL水平低于A組，SAT Vaspin mRNA相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見表4。

表4 兩組大鼠FPG、FINS、血脂及SAT與PAT Vaspin測定結(jié)果（±s，n＝8）

表4 兩組大鼠FPG、FINS、血脂及SAT與PAT Vaspin測定結(jié)果（±s，n＝8）

注：與A組比較，＊P＜0．05

組別 FPG（mmol／L）FINS（mIU／L） TC（mmol／L） TG（mmol／L） LDL（mmol／L）HDL（mmol／L） SATVaspin PAT Vaspin A組 5．20±0．31 24．35±6．50 3．53±0．31 0．74±0．12 1．29±0．23 1．27±0．13 1．00±0．00 2．41±0．24 B組 5．67±0．33＊ 36．21±7．11＊ 4．60±0．32＊ 1．09±0．15＊ 2．24±＋0．24＊ 1．03±0．10＊ 1．02±0．15 3．31±0．27＊

討 論

Vaspin是Hida等［4］于2005年首次在肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織分離到的具有胰島素增敏作用的脂肪細(xì)胞因子，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的典型特征，主要由脂肪細(xì)胞分泌，在肥胖大鼠的脂肪組織中高表達(dá)，低或不表達(dá)于消瘦大鼠的非脂肪組織，Vaspin在白色脂肪組織特異性表達(dá)，免疫組化證實其定位在胞質(zhì)中，也分布到血循環(huán)。研究顯示，血清Vaspin濃度具有明顯的性別差異性，女性高于男性，且超重的多囊卵巢綜合癥患者血清Vaspin水平顯著高于年齡、BMI和WHR匹配的非多囊卵巢綜合征的正常女性［5］，其睪酮、雄烯二酮、血清雌二醇和硫酸脫氫表雄酮亦顯著升高。進(jìn)一步用不同劑量的睪酮、雄烯二酮、雌二醇和硫酸脫氫表雄酮處理網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)雌二醇呈劑量依賴性的增加Vaspin的表達(dá)，而硫酸脫氫表雄酮可顯著增加Vaspin凈蛋白的合成，故有學(xué)者認(rèn)為Vaspin可能與瘦素、脂聯(lián)素一樣也受性激素或腎上腺激素的調(diào)控，但Vaspin性別差異性的具體原因仍有待于進(jìn)一步的研究。Li等［6］研究發(fā)現(xiàn)，運動員組血清Vaspin濃度與糖耐量正常組相比顯著降低，且正常對照組在經(jīng)過4周運動后血清Vaspin濃度較運動前亦明顯降低；此外，行胃旁路術(shù)術(shù)后1年受試者體重下降，血清Vaspin、瘦素、胰島素、C肽、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數(shù)均降低，即血清Vaspin水平與總體脂含量正相關(guān)，然而2型糖尿病患者的血清Vaspin水平與BMI并不存在相關(guān)性，無2型糖尿病的肥胖患者與對照組相比其脂肪組織Vaspin mRNA的表達(dá)顯著增加［7］。

本試驗中大鼠斷乳后直接給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，幼鼠體重超過普通飲食組大鼠體重的20%，且AC、FPG、FINS、TC、TG、及 LDL明顯升高，HDL水平降低，結(jié)果提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型建立成功。雌性肥胖大鼠與對照大鼠PAT與SAT均可檢測到Vaspin mRNA表達(dá)，這與以往研究［3］顯示不僅高脂誘導(dǎo)肥胖雄性大鼠附睪脂肪組織、SAT中均能檢測到Vaspin蛋白，正常大鼠附睪脂肪組織、SAT中也可以檢測到少量Vaspin蛋白表達(dá)一致；PAT Vaspin mRNA水平明顯升高，SAT Vaspin mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即與SAT相比，內(nèi)臟脂肪組織具有更為活躍的內(nèi)分泌功能。

除高脂飲食，Vaspin水平還受進(jìn)餐、日周期等因素影響［7，8］，并且與肥胖相關(guān)的血管并發(fā)癥如糖尿病的血管并發(fā)癥、高血壓以及動脈粥樣硬化等有關(guān)［9，10］。Vaspin的胰島素增敏的作用機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)［11，12］，Vaspin通過調(diào)控白色脂肪組織中與胰島素抵抗相關(guān)基因（如瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子－α、白細(xì)胞介素－6、葡萄糖轉(zhuǎn)運體－4、可溶性瘦素受體和脂聯(lián)素）的表達(dá)而改善胰島素抵抗。然而，在體外小鼠脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Vaspin，或者給非肥胖的小鼠注射Vaspin并不能增加組織的葡萄糖攝取率或改善糖耐量［3］。由此推測，某種條件下的肥胖狀態(tài)Vaspin發(fā)揮了靶向增加白色脂肪胰島素敏感性的功能，可能抑制某種來源于脂肪組織或其他組織的未知的蛋白酶，而這種蛋白酶在體內(nèi)可能具有削弱胰島素敏感性的作用。因此，Vaspin改善胰島素抵抗的作用可能需在其靶蛋白酶存在的條件下才能奏效，但Vaspin的靶蛋白酶迄今尚未知曉，有待進(jìn)一步研究證實。

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