ALDH1、EpCAM及Ki67 mRNA在大腸癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及意義

黃 芳， 錢國(guó)偉， 劉俊杰， 白 津， 裴冬生， 鄭駿年

大腸癌術(shù)后的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響5年生存率的重要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移有直接關(guān)系，但只有極少數(shù)CTC具有轉(zhuǎn)移潛能[1-3]。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的直接原因。本研究將具有干細(xì)胞標(biāo)志的EpCAM、ALDH1及增殖標(biāo)志Ki67作為目的基因，采用定量PCR-Taqman探針?lè)z測(cè)其在大腸癌患者外周血中的表達(dá)量，初步探索其與大腸癌的臨床、病理表現(xiàn)的關(guān)系及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2010年7月1日至2010年12月1日，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科術(shù)前經(jīng)腸鏡及病理證實(shí)的55例大腸癌患者，未接受過(guò)任何抗腫瘤治療和免疫治療，其中男24例，女31例；60歲及60歲以上24例， 60歲以下31例；腺癌44例，非腺癌11例；腫瘤直徑≥5 cm的27例；浸潤(rùn)深度達(dá)到或超過(guò)漿膜層39例；神經(jīng)脈管侵犯27例；有癌結(jié)節(jié)10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5例；高、中、低分化的例數(shù)分別為10例、36例、9例； TNM分期(參照AJCC 2002版TNM分期標(biāo)準(zhǔn))0～Ⅳ期病例數(shù)分別為：5、8、21、16、5；血清CEA增高14例；血清CA199增高10例。對(duì)照組樣本來(lái)自56例健康志愿者，年齡18～80歲。本研究中臨床標(biāo)本的采集均經(jīng)徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和材料

血液總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連Takara公司，pGEM-T Easy Vector購(gòu)自美國(guó)Promega公司，定量PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞株：人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，人急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞系Sup-B15購(gòu)自北京中原公司。EpCAM 和Ki67引物及Taqman探針序列均來(lái)自文獻(xiàn)，ALDH1引物和Taqman探針采用Primer 3軟件設(shè)計(jì)(F：5′TCCAGCCCACAGTGTTCTCTAAT3′，R：5′GATTTGCTGCACTGGTCCAA3′,Probe：5′TTACAGATGAGATGCGCATT3′，80bp)，所用引物和探針均由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)前采集新鮮的肘靜脈血7 mL，前5 mL用于其他項(xiàng)目檢查。后2 mL 用EDTA抗凝，在采集后2小時(shí)內(nèi)從全血中提取單個(gè)核細(xì)胞的總RNA并凍存于-80 ℃保存。

1.3.2 定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板構(gòu)建 使用RT-PCR法從培養(yǎng)的細(xì)胞(SW620和Sup-B15細(xì)胞株)中獲取EpCAM、ALDH1及 Ki67基因的目的片段，將其分別插入pGEM-T載體，構(gòu)建三個(gè)質(zhì)粒pGEM-T-ALDH1、pGEM-T-EpCAM和pGEM-T-Ki67，并分別按108、107、106、105、104、103copies/μL梯度稀釋，制作熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 檢測(cè)方法 用熒光定量PCR Taqman探針?lè)z測(cè)樣本中靶基因ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA的表達(dá)，規(guī)定每例樣本取400 ng總RNA加入20 μL反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL的cDNA做定量PCR檢測(cè)模板，以95%正常值范圍作為參考值。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)不滿足正態(tài)性和方差齊性的計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，各檢測(cè)指標(biāo)與臨床各病理參數(shù)的關(guān)系采用多重線性回歸分析，各檢測(cè)指標(biāo)之間的關(guān)系采用簡(jiǎn)單線性回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA的表達(dá)

定量熒光PCR Taqman法檢測(cè)大腸癌組外周靜脈血中ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA(每40 ng總RNA中)的表達(dá)量均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。大腸癌組ALDH1、EpCAM、Ki67mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.9%(6/55)、41.8%(23/55)、45.5%(25/55)。

表1 大腸癌組和健康對(duì)照組ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA(每40 ng總RNA中)的中位拷貝數(shù)

2.2 ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA表達(dá)量與大腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

多重線性回歸分析大腸癌組ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系顯示，ALDH1與浸潤(rùn)深度(P=0.022)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.048)相關(guān)；EpCAM與TNM分期(P=0.013)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.033)相關(guān)；Ki67與性別、年齡、腫瘤大小等臨床病理參數(shù)均無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2 Ki67、EpCAM 、ALDH1mRNA的表達(dá)量與大腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 Ki67、EpCAM、ALDH1間的關(guān)系

簡(jiǎn)單線性回歸分析，表明EpCAM和ALDH1之間有線性回歸關(guān)系，Ki67和ALDH1之間有線性回歸關(guān)系，但Ki67和EpCAM之間無(wú)線性回歸關(guān)系，見(jiàn)表3。

表3 Ki67、EpCAM與ALDH1之間的線性關(guān)系

3 討論

定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)和診斷。研究表明用定量PCR分析CTC的表達(dá)與用Cell Search檢測(cè)的效率相當(dāng)(80%～85%)[4]。另有多組研究證實(shí)用qRT-PCR分子學(xué)方法來(lái)檢測(cè)腫瘤患者外周血中的微小轉(zhuǎn)移有助于評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)測(cè)和判斷療效[5-6]。

由于CTC數(shù)量很少且很難捕獲，大多數(shù)傳統(tǒng)的分離策略都會(huì)丟失掉部分的腫瘤細(xì)胞[2]，如何能在外周血中準(zhǔn)確的檢測(cè)到其中極少數(shù)具有異處成瘤能力的CTC是目前CTC研究領(lǐng)域的巨大挑戰(zhàn)[3]。EpCAM是一種上皮細(xì)胞黏附分子，在上皮來(lái)源的腫瘤組織中強(qiáng)表達(dá)，具有維持癌干細(xì)胞增殖、自我更新、非貼壁依賴性生長(zhǎng)及侵襲的能力[7]。ALDH1作為結(jié)腸癌CSC標(biāo)記物比CD44+/CD133+特異性更強(qiáng)[8]。Ki67作為細(xì)胞增殖標(biāo)記可用來(lái)評(píng)估CTC及CSC的增殖能力。本研究采取先裂解全血中紅細(xì)胞的辦法獲得單個(gè)核細(xì)胞，避免分選過(guò)程中造成CTC的丟失，之后用FQ-PCR Taqman法檢測(cè)大腸癌的兩個(gè)重要的干細(xì)胞標(biāo)志EpCAM和ALDH1的表達(dá)，以期能從分子生物學(xué)水平檢測(cè)出CTC中真正有臨床意義的微轉(zhuǎn)移。

本研究55例大腸癌患者中ALDH1陽(yáng)性率10.9%(6例)，與腫瘤干細(xì)胞數(shù)量少、表達(dá)率低的特點(diǎn)相符。ALDH1與浸潤(rùn)深度(P=0.022)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.048)，EpCAM與TNM分期(P=0.013)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.033)，提示EpCAM陽(yáng)性、ALDH1陽(yáng)性的CTC可能具有一定的CSC潛能，具有一定的惡性侵襲能力和引起轉(zhuǎn)移的能力，可能在這部分的CTC中存在著一些具有“種子”能力的CSC即轉(zhuǎn)移腫瘤干細(xì)胞(MCSC)。

維持靜止休眠狀態(tài)是CSC保持其干細(xì)胞功能的關(guān)鍵，也是其逃避抗增殖化療的方式[9]。本研究顯示在ALDH1陽(yáng)性患者中有83.3%(5/6)患者表達(dá)Ki67，且Ki67與ALDH1有線性回歸關(guān)系(P=0.000)，提示外周循環(huán)CTC的增殖能力可能隨著CSC標(biāo)志物ALDH1表達(dá)的增高而增高。但僅依據(jù)分子生物學(xué)的檢測(cè)還不能直接推斷CTC整體增殖能力的增高完全與CSC的增多有關(guān)。根據(jù)干細(xì)胞理論，隨著CSC的增多，將會(huì)伴隨著更多具有有限增殖能力的由CSC分化的各個(gè)階段腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，必然會(huì)有Ki67升高。這暗示CTC中Ki67 及ALDH1表達(dá)的增高可能在一定程度上間接反應(yīng)了CSC的激活狀態(tài)。

細(xì)胞增殖異常與腫瘤的關(guān)系一直受到廣泛關(guān)注，但是關(guān)于CTC的增殖狀態(tài)目前存在爭(zhēng)議[10]。本研究顯示55例大腸癌中Ki67陽(yáng)性的有25例(45.5%)，Ki67的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小等臨床病理參數(shù)均無(wú)相關(guān)性，這從分子生物學(xué)水平說(shuō)明只有部分大腸癌患者的CTC是具有增殖能力的，但是這種增殖能力并不能完全代表CTC的惡性侵襲能力。

綜上所述，定量PCR法檢測(cè)大腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中ALDH1、EpCAM、Ki67 mRNA的表達(dá)作為一種簡(jiǎn)便可行的分子生物學(xué)方法，可以為大腸癌患者的分期、預(yù)后及個(gè)體化治療提供有價(jià)值的信息。

[1] Nelson NJ.Circulating tumor cells: will they be clinically useful[J].J Natl Cancer Inst,2010,102(3):146-148.

[2] Kaiser J.Medicine.Cancer’s Circulation Problem[J].Science,2010,327(5969): 1072-1074.

[3] Nagrath S,Sequist LV,Maheswaran S,et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J].Nature,2007,450(7173):1235-1239.

[4] Helo P,Cronin AM,Danila DC,et al.Circulating prostate tumor cells detected by reverse transcription-PCR in men with localized or castration-refractory prostate cancer: concordance with CellSearch assay and association with bone metastases and with survival[J].Clin Chem,2009,55(4): 765-773.

[5] Tewes M,Aktas B,Welt A,et al.Molecular profiling and predictive value of circulating tumor cellsin patients with metastatic breast cancer: an option for monitoring response to breast cancer related therapies[J].Breast Cancer Res Treat,2009,115(3): 581-590.

[6] Koyanagi K,Bilchik AJ,Saha S,et al.Prognostic relevance of occult nodal micrometastases and circulating tumor cells in colorectal cancer in a prospective multicenter trial[J].Clin Cancer Res,2008,14(22): 7391-7396.

[7] Munz M,Baeuerle PA,Gires O,et al.The emerging role of EpCAM in cancer and stem cell signaling[J].Cancer Res,2009,69(14): 5627-5629.

[8] Huang EH,Hynes MJ,Zhang T,et al.Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells(SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis[J].Cancer Res,2009,69(8): 3382-3389.

[9] Lianidoul ES,Mavroudis D,Sotiropoulou G,et al.What’s new on circulating tumor cells A meeting report[J].Breast Cancer Research,2010,12(4):307.

[10] Pantel K,Brakenhoff RH,Brandt B,et al.Detection,clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells[J].Nat Rev Cancer,2008,8(5):329-340.