貴州野生淡黃花百合RAPD反應(yīng)體系的建立

摘要：以貴州林下野生淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）幼嫩葉片為材料，采用改良的CTAB法提取百合基因組DNA，得到了較高質(zhì)量的DNA。并對影響隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA性（RAPD）反應(yīng)的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立并優(yōu)化了野生淡黃花百合的RAPD反應(yīng)體系及程序。優(yōu)化的20 μL反應(yīng)體系中包含20 ng模板DNA，2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer 2 μL、0.4 μmol/L隨機(jī)引物、ddH2O補(bǔ)足至20 μL。優(yōu)化的RAPD擴(kuò)增程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。該反應(yīng)體系具有較好的穩(wěn)定性及可重復(fù)性，適合貴州野生淡黃花百合遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞：淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）；DNA提??；RAPD

中圖分類號：Q523 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439—8114（2012）19—4393—03

百合又名夜合、中蓬薯、蒜腦薯、強(qiáng)瞿等，素有“球根花卉之王”的美譽[1]，系百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物[2，3]，其用途廣泛，具有藥用、食用、觀賞價值，是中國衛(wèi)生部審批通過的首批藥食兩用植物[4]。中國是百合屬植物自然分布的中心，分布有55種及18個變種[5，6]。但目前大部分百合栽培品種非中國育成，開發(fā)中國百合野生種質(zhì)資源，對培育高質(zhì)量新品種百合具有非常重要的意義[7]。貴州省地理環(huán)境復(fù)雜多樣，野生百合資源豐富，其中淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）分布廣泛，是貴州省食品企業(yè)制作百合粉的主要原料[8]。為更好地開發(fā)利用和保護(hù)貴州省的野生百合資源，本實驗以淡黃花百合為材料，探討適合于貴州野生百合的RAPD反應(yīng)體系，為進(jìn)一步分析貴州野生百合遺傳多樣性及親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

野生淡黃花百合采自貴州務(wù)川縣野生林下，2011年種植于遵義師范學(xué)院生物系植物園地內(nèi)，待萌芽后采集新鮮幼嫩無病蟲害的葉片于封口袋（100 mg/袋），置冰盒中帶回實驗室，—80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2 000 Marker、瓊脂糖、CTAB等均購自天根生化科技（北京）有限公司；引物（S1027，ACGAGCATGG）購自上海捷瑞生物工程有限公司；氯仿、異戊醇、無水乙醇、EDTA、異丙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR儀、凝膠成像儀均為美國伯樂公司產(chǎn)品，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 淡黃花百合基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法提取淡黃花百合基因組DNA[9]。取200 mg百合葉片，液氮研磨至粉末，置于2 mL離心管中，加入600 μL 65 ℃預(yù)熱的2%CTAB提取液，65 ℃水浴30 min，其間每隔10 min輕輕顛倒離心管1次；然后加入等體積的酚—氯仿—異戊醇（體積比25∶24∶1，下同）混合液混勻，12 000 r/min離心10 min；取上清液，用酚—氯仿—異戊醇試劑再抽提1次，12 000 r/min離心10 min，取上清液；加入700 μL預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，12 000 r/min離心10 min，可見白色沉淀；用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇漂洗沉淀，棄上清，在干凈吸水紙上倒置離心管，去除殘留的乙醇，溶于60 μL TE中，4 ℃冰箱過夜溶解，—20 ℃保存。

1.2.2 DNA的檢測 用紫外分光光度計測定百合DNA在260 nm和280 nm波長下的吸光度，依據(jù)A260 nm/A280 nm判斷所提取DNA的純度。取5 μL百合DNA樣品進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳（5 V/cm、1 h），在凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.2.3 RAPD反應(yīng)條件優(yōu)化 隨機(jī)選取6個貴州野生淡黃花百合樣本進(jìn)行擴(kuò)增。RAPD反應(yīng)體系為20 μL，設(shè)置單因素實驗分別對模板DNA用量（10、20、40、60、80 ng）、Mg2+濃度（1.50、1.75、2.00、2.25、2.55 mmol/L）、dNTPs濃度（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L）、Taq DNA聚合酶用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U）、隨機(jī)引物濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L）及RAPD反應(yīng)程序中的退火溫度（35、36、37、38、39 ℃）、循環(huán)次數(shù)（25、30、35、40、45）等影響因素進(jìn)行考察，找出適合于貴州野生淡黃百合RAPD反應(yīng)的條件。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（5 V/cm、1 h）進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生淡黃花百合基因組DNA的提取結(jié)果

以野生貴州淡黃花百合嫩葉片為材料，采用改良的CTAB法提取其基因組DNA，紫外分光光度法檢測結(jié)果顯示提取的DNA A260 nm/A280 nm均在1.9左右，DNA濃度在200 ng/μL以上；隨機(jī)挑選6個樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1?？梢钥闯?，提取的DNA條帶清晰，無拖尾降解現(xiàn)象，其質(zhì)量和純度均達(dá)到了RAPD反應(yīng)模板的要求。

2.2 RAPD反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果 單因素實驗結(jié)果表明，野生淡黃花百合RAPD反應(yīng)體系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及引物濃度均對RAPD反應(yīng)的效果有較大影響。①模板DNA用量。模板DNA的用量過高或過低均可能導(dǎo)致擴(kuò)增不成功，20 μL反應(yīng)體系中，模板DNA用量在10～80 ng時均有擴(kuò)增產(chǎn)物，但為20 ng時條帶清晰，弱帶能得到較好的顯示，是最適的模板DNA用量。②Mg2+濃度。PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低則會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。本實驗中Mg2+濃度為2.0 mmol/L時擴(kuò)增效果最好，擴(kuò)增條帶的明亮度、清晰度和穩(wěn)定性都較好。③dNTPs濃度。PCR反應(yīng)體系中，高濃度的dNTPs可加速反應(yīng)，但同時會增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高反應(yīng)的精確性，但也會降低反應(yīng)速度和PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。本實驗中dNTPs濃度為0.25 mmol/L時，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明亮而清晰。④Taq DNA聚合酶用量。Taq DNA聚合酶是影響PCR反應(yīng)成功率的關(guān)鍵因素，一般來說，隨著Taq DNA聚合酶用量的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈增多趨勢，但Taq DNA聚合酶用量過多，不僅會增加實驗成本，而且會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。本研究中Taq DNA聚合酶用量為1.0 U時，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶數(shù)量多且較清晰；用量上升到1.5 U時，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶帶型模糊，有彌散背景，給分析帶來困難。⑤引物濃度。PCR反應(yīng)體系中引物濃度過低，會導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量低，濃度過高則會導(dǎo)致引物二聚體的形成，不利于實驗分析。本實驗中引物濃度為0.4 μmol/L時，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰銳利；濃度為0.2 μmol/L時弱帶消失；大于0.4 μmol/L時引物二聚體的數(shù)量增加。

綜上所述，最終確定在20 μL反應(yīng)體系中含20 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer 2 μL、0.4 μmol/L隨機(jī)引物，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

2.2.2 RAPD反應(yīng)程序的優(yōu)化結(jié)果 退火溫度和循環(huán)次數(shù)是影響PCR反應(yīng)能否成功的關(guān)鍵因素。在PCR反應(yīng)程序中，退火溫度要足夠低才能保證引物及目的序列的有效退火，但同時也不能過低，以減少非特異性結(jié)合。同樣，PCR循環(huán)次數(shù)過多將導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，降低PCR反應(yīng)的特異性；而循環(huán)數(shù)過少又會使PCR反應(yīng)產(chǎn)量過低。實驗發(fā)現(xiàn)在37 ℃退火40 s時，PCR產(chǎn)物譜帶清晰，特異性最強(qiáng)。而循環(huán)次數(shù)少于35次時，DNA不能得到充分的擴(kuò)增，擴(kuò)增帶少而模糊；循環(huán)次數(shù)為40次時帶型清晰、穩(wěn)定；循環(huán)次數(shù)增加到45次，非特異性條帶增多。因此，優(yōu)化的RAPD擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性50 s，37 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

隨機(jī)選取6個貴州野生淡黃花百合樣本，按優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，擴(kuò)增的6個樣本特異性條帶清晰，并呈現(xiàn)出一定的多樣性，能滿足貴州野生淡黃花百合RAPD遺傳多樣性分析。

3 結(jié)論與討論

高質(zhì)量基因組DNA的提取是RAPD成功的前提[10]，不同植物的基因組提取必須采取與之相適宜的方法。之前的報道常采用百合的入藥部位鱗葉或地上部嫩葉進(jìn)行基因組DNA的提取。百合鱗葉富含大量的次生代謝產(chǎn)物，提取高質(zhì)量的基因組DNA難度較大，因此本實驗選擇百合的嫩葉作為材料，并選擇能有效去除嫩葉中糖、酚等雜質(zhì)的CTAB法，獲得的DNA質(zhì)量較高，純度及濃度檢測結(jié)果表明其能滿足后續(xù)實驗的要求。

RAPD反應(yīng)體系中任何因素的變化都會影響到擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量。因此通過單因素實驗對影響RAPD反應(yīng)的多個因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定適合貴州野生淡黃花百合的RAPD擴(kuò)增體系（20 μL）為20 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、10×Buffer 2 μL、0.4 μmol/L隨機(jī)引物、ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性50 s，37 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)該條件下的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，特異性強(qiáng)，為下一步進(jìn)行貴州野生淡黃百合RAPD遺傳多樣性研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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