酶解法提取玉米須中總黃酮工藝的優(yōu)化

摘要：以乙醇溶液為提取劑，采用纖維素酶酶解的方法從玉米（Zea mays）須中提取總黃酮。設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)分析了酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比等6個(gè)因素對(duì)玉米須中總黃酮提取率的影響，采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化總黃酮提取的工藝條件。結(jié)果表明，酶法提取玉米須中總黃酮的最佳工藝條件為每5.0 g干燥的玉米須粉末中加入3.0 g纖維素酶、酶解溫度45.00 ℃、酶解時(shí)間149.1 min、pH 4.49、體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液作為提取溶劑、料液比1∶20（m∶V，g/mL），此條件下玉米須總黃酮的提取率可達(dá)0.837%。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays）須；總黃酮；纖維素酶；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439—8114（2012）19—4333—04

玉米須是玉米（Zea mays）干燥的花柱和柱頭，也被稱為玉蜀黍蕊、棒子毛等，是玉米的下腳料。中國的玉米產(chǎn)量居于世界領(lǐng)先地位，每年收獲玉米的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的玉米須。然而目前僅有少量玉米須被用作傳統(tǒng)的中藥材，大部分被白白丟棄。玉米須在環(huán)境中長期堆放會(huì)滋生大量有害的生物，如霉菌、螨類等。對(duì)玉米須進(jìn)行有效的處理，在實(shí)現(xiàn)生物資源有效利用的同時(shí)減少環(huán)境污染是一個(gè)亟待解決的課題。

醫(yī)學(xué)上認(rèn)為玉米須具有顯著的利尿、降血糖[1]、抑菌[2]、降壓、增強(qiáng)免疫、抗癌的功效[3]，既有明顯的藥用價(jià)值，又具備一定的食療特征[4]。研究人員已經(jīng)從玉米須中分離鑒定出了黃酮類、苷類、甾類、生物堿、糖類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、微量元素和維生素等多種活性物質(zhì)[5]。本試驗(yàn)使用酶解法提取玉米須中的總黃酮，并設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)考察了酶用量、提取溫度、提取時(shí)間、pH、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)和料液比等因素對(duì)黃酮提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以最大限度地保持黃酮的穩(wěn)定性并提高黃酮的得率，為玉米須的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米須為常規(guī)型甜玉米花柱頭，購買于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校門口的集貿(mào)市場(chǎng)。選取質(zhì)地均勻的玉米須，40 ℃干燥、粉碎，過60目篩，保存在陰涼干燥處。

主要試劑亞硝酸鈉（上海青析化科技有限公司）、硝酸鋁（上海新寶精細(xì)化工廠）、氫氧化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、鋅粉（湖南湘中化學(xué)試劑采供站）、鹽酸（信陽市化學(xué)試劑廠）、乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）均為分析純；蘆丁（上海辰云化工有限公司）、纖維素酶（武漢市華順生物技術(shù)有限公司）。

主要儀器有分光光度計(jì)（725型）、天平（FA1104N），上海精密儀器科學(xué)有限公司；恒溫水浴鍋（DF—101s型）、循環(huán)水真空泵（SHB—D型），鄭州長城儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Zfa—84型），上海機(jī)械專機(jī)廠；植物粉碎機(jī)，北京醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其分別稀釋至0.016、0.032、0.048、0.064和0.080 mg/mL，在510 nm處檢測(cè)其吸光度，得到蘆丁溶液濃度X（mg/mL）對(duì)吸光度A510 nm（Y）的線性回歸方程為Y=9.978X+0.002，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 設(shè)置單因素試驗(yàn)分別考察酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響。①酶用量。取5份干燥玉米須粉末5.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液100 mL，酶的用量分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g（酶活力單位60 U/g），pH 5.0、45 ℃酶解120 min。②酶解溫度。取5份干燥玉米須粉末5.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液100 mL，調(diào)節(jié)體系pH為5.0，酶用量3.0 g，酶解溫度分別為35、40、45、55、60 ℃，酶解時(shí)間120 min。③酶解時(shí)間。取5份干燥玉米須5.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液100 mL，調(diào)節(jié)體系pH為5.0，酶用量3.0 g，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間分別為60、90、120、150、180 min。④pH。取5份干燥玉米須5.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液100 mL，酶用量3.0 g，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH分別為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5，45 ℃酶解150 min。⑤乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)。取5份干燥玉米須5.0 g，分別加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，酶用量為3.0 g，pH 4.5、45 ℃酶解150 min。⑥料液比。取5份干燥玉米須5.0 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（m∶V，g/L，下同）加入體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液，酶用量為3.0 g，pH 4.5、45 ℃酶解150 min。各單因素試驗(yàn)酶解反應(yīng)完成后迅速升溫至90 ℃以上充分滅活10 min，過濾，轉(zhuǎn)移濾液至250 mL容量瓶定容，測(cè)定A510 nm，計(jì)算總黃酮提取率。

1.2.3 Box—Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果以及Box—Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[6]，在酶用量為原料質(zhì)量的60%、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1∶20的條件下設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，考察酶解溫度、pH和酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)試驗(yàn)。Box—Benhnken試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響 玉米須總黃酮的提取率隨酶用量的不同而不同（圖1），其先隨著酶用量的增加而不斷上升，酶用量為3.0 g時(shí)達(dá)到最大，為0.82%；繼續(xù)增加酶的用量，總黃酮的提取率反而下降，可能的原因是酶的用量較低時(shí)其可與玉米須底物充分結(jié)合，但當(dāng)?shù)孜锊荒軐?duì)酶達(dá)到飽和的時(shí)候，酶的活性會(huì)受到抑制。

2.1.2 酶解溫度對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響 隨著酶解溫度的升高，玉米須總黃酮的提取率先不斷上升，在溫度為45 ℃時(shí)達(dá)到最高，為0.79%；溫度再上升，總黃酮的提取率反而下降（圖2），可見試驗(yàn)所用酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響 隨著酶解時(shí)間的延長，玉米須總黃酮的提取率先上升，當(dāng)酶解時(shí)間為150 min時(shí)提取率達(dá)到最大，為0.82%；繼續(xù)延長酶解時(shí)間，總黃酮的提取率反而下降（圖3），可能的原因是反應(yīng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系中已溶出的總黃酮發(fā)生降解。

2.1.4 pH對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響 隨著酶解體系pH的升高，玉米須總黃酮的提取率先不斷上升，當(dāng)pH為4.5時(shí)提取率最高，達(dá)0.81%；之后pH再上升，總黃酮的提取率反而下降（圖4），可見試驗(yàn)所用酶的最適pH為4.5。

2.1.5 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響 提取劑乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)玉米須總黃酮提取率有較大的影響。乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)過高或過低都會(huì)降低總黃酮的提取率（圖5）。用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液作提取溶劑提取率最高，為0.82%。可能的原因是黃酮是醇溶性的，較高的乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)有利于黃酮的溶出，但是乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)過高會(huì)抑制酶的活性。

2.1.6 料液比對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響 料液比對(duì)玉米須總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著提取劑乙醇溶液的用量增加，總黃酮的提取率先上升，料液比為1∶20時(shí)最大，為0.82%；之后再增加溶劑的用量，提取率反而下降。可能的原因是乙醇溶液用量過少時(shí)黃酮和酶不能充分溶于溶劑中；而溶劑用量過大會(huì)使反應(yīng)體系中酶的濃度下降，從而降低了提取率。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 Box—Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。以玉米須總黃酮的提取率為響應(yīng)值Y，通過SAS軟件的RSREG程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析（RSA），經(jīng)二次回歸擬合求得響應(yīng)函數(shù)?；貧w方程為：Y=—24.505 509 +0.427 190X1+5.438 214X2+0.047 106X3—0.004 312X12—0.010 356X1X2

—0.556 502X22 + 0.000 050 X1X3 + 0.000 195 X2X3—

0.000 169X32，其決定系數(shù)R2為0.975 2。從表2可以看出，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值十分接近。

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。模型的F=21.89（P<0.01），二次響應(yīng)面回歸模型有高度顯著性，二次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平，可見各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由3個(gè)因素引起的總黃酮提取率的變異為97.52%，方程擬合很好，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，無須進(jìn)行更高次的擬合。從方差分析結(jié)果可以看出各因素對(duì)總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)槊附鈺r(shí)間、pH、酶解溫度，且3個(gè)因素的影響均達(dá)到了極顯著水平。

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析 分別固定X1、X2、X3繪制另2個(gè)因素之間的響應(yīng)面圖和等高線圖（圖7—圖9），結(jié)合響應(yīng)面圖可求解出最佳工藝條件下的特征向量、特征值點(diǎn)坐標(biāo)及最佳工藝條件下的提取率（表4）。3個(gè)因素的特征值均為負(fù)，表明此二次響應(yīng)面有極值存在，可以直接從此二次響應(yīng)面上找出最佳工藝參數(shù)。當(dāng)特征值X1、X2、X3分別為—0.102 958、—0.142 995、—0.152 632時(shí)，臨界點(diǎn)（0.000 493，

—0.013 129，—0.031 092）是最大值點(diǎn)。由臨界點(diǎn)確定最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度45.00 ℃，pH 4.49，酶解時(shí)間149.1 min，預(yù)測(cè)最大提取率為0.836%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮的提取率為0.837%，與理論值沒有顯著差異，可見本試驗(yàn)優(yōu)化得到的乙醇酶解法提取玉米須中總黃酮的工藝條件是可靠的。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)得到優(yōu)化的酶解法提取玉米須中總黃酮的條件為每5.0 g干燥的玉米須粉末中加入3.0 g纖維素酶、酶解溫度45.00 ℃、酶解時(shí)間149.1 min、pH 4.49、溶劑乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為30%、料液比1∶20。此條件下玉米須中總黃酮的提取率可達(dá)0.837%。以玉米須為原料提取總黃酮，材料來源廣泛，提取工藝簡(jiǎn)單，所得產(chǎn)品穩(wěn)定性好，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。

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