揭秘化妝品安全性評價技術(shù)（八）
2012-12-29 00:00:00劉超
中國化妝品 2012年1期
化妝品中存在許多光感性物質(zhì)，如含有共軛結(jié)構(gòu)的防曬劑、指甲油和唇膏的某些著色劑、用于化妝品中的殺菌劑三氧N-碳酸苯胺、三氯生，含香豆素類的某些植物提取物（如甘菊環(huán)烴、六-甲基香豆素、貫葉金絲桃提取物、茉莉、肉桂、葵子麝香），以及藥物和某些功能性化妝品（特殊用途化妝品）原料如氯丙嗪、鹽酸氯丙嗪氟喹諾酮、噻嗪、酚噻嗪、磺胺、喹啉、苯酮等。這些物質(zhì)通過接觸、口服、注射等途徑進入體內(nèi)，與一定照射劑量的光線或紫外線接觸后誘發(fā)的不良反應(yīng)均可稱之為光毒性效應(yīng)，具體可包括皮膚毒性反應(yīng)、遲發(fā)性免疫反應(yīng)、光遺傳毒性和光致癌性等。
各國化妝品法規(guī)均規(guī)定，能吸收紫外線的化妝品成分和化妝品成分的混合物（用于紫外線過濾劑的化學(xué)物，例如用于確保化妝品的光穩(wěn)定性或用于防曬產(chǎn)品中）應(yīng)進行急性光毒性和潛在光遺傳毒性測試。對于潛在光致敏性和光遺傳毒性的測試不作特別要求，但這類試驗也常進行。
一、光毒性效應(yīng)及臨床表現(xiàn)
紫外線是由原子的最外層電子從高能級向低能級躍遷時以光形式釋放的能量，根據(jù)波長范圍分為UVA(315nm～400nm)、UVB(280nm～315nm)和UVC?(100nm～280nm)，不同波長的紫外線產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。紫外線的主要作用是激發(fā)或催化物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)作用，除用于殺菌外，過量的紫外線照射誘發(fā)皮膚光毒性效應(yīng)。臨床表現(xiàn)主要有以下幾種：
1、光毒性皮炎：指化妝品中某些物質(zhì)能增強皮膚對光的敏感性，日光照射激活此類物質(zhì)對皮膚產(chǎn)生刺激作用而導(dǎo)致皮膚損傷，與免疫無關(guān)。指甲油和唇膏中常用的著色劑，如熒光素和曙紅為光敏劑。煤焦油和瀝青等物質(zhì)中含有強光敏性物質(zhì)蒽、甲基蒽及熒蒽等，當(dāng)UV照射到吸收了這些物質(zhì)的皮膚時，可與皮膚發(fā)生光毒性炎癥反應(yīng)。長期職業(yè)接觸煤焦油和瀝青可形成職業(yè)性黑變病。
2、光變應(yīng)性接觸性皮炎：是接觸光變應(yīng)原物質(zhì)后，在暴露于光線的部位出現(xiàn)的皮膚炎癥反應(yīng)，而在不接觸光的部位則不出現(xiàn)這種反應(yīng)。該變應(yīng)性反應(yīng)屬于T細胞介導(dǎo)的濕疹樣反應(yīng)，表現(xiàn)以濕疹為特征，在暴露部位出現(xiàn)小皰疹和發(fā)展為大皰疹，并伴有脫屑、結(jié)痂，慢性階段可出現(xiàn)苔癬樣皮膚增厚。例如皮膚接觸含有對羥基甲酸及其酯類物質(zhì)等變應(yīng)原的防曬化妝品，只要一次接觸日光即可發(fā)生此類皮炎并持續(xù)1周左右。葵子麝香是重要的光變應(yīng)原，皮膚使用含該香料的化妝品可引發(fā)光變應(yīng)性皮炎，甚至可發(fā)展為持久性光敏反應(yīng)。接觸含煤焦油染料的化妝品可引起光變應(yīng)性皮炎，后期可出現(xiàn)色素沉著，也稱之為“色素性化妝品皮炎”。常見的光致敏原還有磺胺類藥物、吩噻嗪、香豆素、苯胺、香皂和除臭劑中的殺菌劑三氧N-碳酸苯胺、防曬劑中的對氨基苯甲酸衍生物。
3、職業(yè)性色素加深：過度接觸紫外線、日光、紅外線、煤焦油及其衍生物、橡膠改良劑和防老化劑，無機砷、碳素及某些染料，或從事避孕藥及氯丙嗪生產(chǎn)等，均有可能引起皮膚色素增多。波長越短，透入皮膚的深度越小，照射后黑色素沉著較弱，波長越長，透入皮膚的深度越大，照射后黑色素沉著較強。紫外線作用于黑色素細胞，引起黑色素在細胞內(nèi)從底部向表面轉(zhuǎn)移重新分布，造成皮膚色素增加。在UV下照射5min內(nèi)，皮膚可暫時性變黑，稱為曬斑反應(yīng)，主要由長波紫外線UVA引起的。
4、皮膚癌：紫外線是皮膚的主要致癌因素，鱗狀細胞癌和表皮基底細胞癌通常與慢性或過量的UV暴露相關(guān)。部分化學(xué)物質(zhì)也能誘發(fā)皮膚癌，如多環(huán)芳烴和無機砷等還參與UV致癌作用的調(diào)控。
二、光毒性的體內(nèi)實驗
光敏物質(zhì)的共同特點是能吸收300~750?nm波長范圍的光線，吸收光能量后被激活而成為活躍狀態(tài)。按照光化學(xué)第一定律，只有吸收足夠的光量子才能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。因此測定被測物質(zhì)的UV/可見光吸收光譜是任何體外或體內(nèi)生物系統(tǒng)測試光敏特性的前提。具體測定方法可參考OECD試驗指南101和國家GB/T9721-2006《化學(xué)試劑分子吸收分光光度法（紫外可見光部分）》。如果摩爾消光/吸收系數(shù)小于10L/mol-1 cm-1，則該化學(xué)物質(zhì)光吸收低，不可能具有光反應(yīng)性。不必進行任何其它測定光化學(xué)效應(yīng)的生物學(xué)試驗，包括急性光毒性體內(nèi)和體外試驗。
1、人體光斑貼試驗
人體光斑貼試驗是通過在人體皮膚表面直接敷貼受試物，并同時接受一定劑量適當(dāng)波長紫外線照射的方法，檢測誘發(fā)光毒性與光變應(yīng)性皮炎的光敏劑以及檢測機體對某些光敏劑反應(yīng)的一種皮膚試驗。方法和一般斑貼試驗一樣，首先將被檢物貼敷在患者背部或前臂屈側(cè)，同時照射UVB和UVA，測定其最小紅斑量（MED）。24～48h后以3/4MED的光線照射貼敷物的一半，再過48h觀察結(jié)果，如果僅在貼敷物+照射部位發(fā)紅，水腫或發(fā)生小丘疹（有時發(fā)生小水皰）時為陽性反應(yīng)，被檢物質(zhì)即是光感物質(zhì)。
2、光毒性動物實驗
將一定量受試物涂抹在動物去毛的背部皮膚上，經(jīng)一定時間間隔后暴露于UVA光線下，觀察受試動物皮膚反應(yīng)并確定該受試物有否光毒性。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和為2或2以上的動物數(shù)為1只或1只以上時，判為受試物具有光毒性。
三、急性光毒性的體外替代方法
傳統(tǒng)的皮膚光毒性試驗以動物試驗為主，上世紀80年代以來，光毒性的體外替代試驗得到發(fā)較快的發(fā)展，急性光毒性效應(yīng)已找到完全替代動物試驗的方法。目前經(jīng)過驗證的光毒性的試驗方法共三項，分別是體外3T3光毒性中性紅攝取試驗（3T3-NRU-PT）、紅細胞光毒性試驗（RBC-PT）和重建人體皮膚模型光毒性試驗（H3D-PT），后兩種方法是3T3-NRU-PT有效和重要的輔助方法，能彌補3T3-NRUPT的某些不足。其它未經(jīng)驗證的方法是酵母試驗的光雞胚試驗。3T3-NRU-PT是這三種方法中的核心測試法，是目前國際標準和法規(guī)要求的光毒性測試的唯一方法，但在我國還未獲得監(jiān)管部門的認可。當(dāng)某一化學(xué)物的潛在光毒性不能由3T3-NRU-PT法獲得足夠的信息時，還可以用另外兩種體外方法RBC-PT和H3D-PT。
1、3T3成纖維細胞中性紅攝取光毒性試驗（3T3 NRU-PT）
本試驗方法建立的基礎(chǔ)是比較有或無非細胞毒性劑量的刺激性光照射情況下化學(xué)物的細胞毒性。細胞毒性是以受試物在光照射處理24h后，與受試物濃度相關(guān)的細胞攝取活體染料中性紅的還原量來表示的。加有不同濃度受試物的3T3細胞在96孔板中孵育1h。然后，暴露在紫外線/可見光（有效UVA劑量為1.67mW/cm2）50min，24h后測試中性紅在540nm處的光密度值。同時，加有相同化學(xué)物的第二塊板放在暗處做對照板。通過劑量－反應(yīng)曲線的非線性擬合模型計算使細胞活性抑制50%的受試物濃度（IC50）。結(jié)果分析可采用兩種計算模型。一種是光刺激因子（PIF），定義為測得的無UVA照射和有UVA照射時IC50值的比，另一種是平均光效應(yīng)（MPE），即比較化學(xué)物在有UV光和無UV光時獲得的劑量－反應(yīng)曲線下面積，通過數(shù)學(xué)分析導(dǎo)出數(shù)值。如果PIF<2或MPE<0.1時，預(yù)測“無光毒性”；如果2
德國Battelle實驗室最早用人的類皮膚細胞進行體外光細胞毒性試驗，后來，Beiersdorf（德國漢堡）實驗室用開發(fā)了Balb/c 小鼠成纖維細胞3T3 NRU-PT光毒性試驗方法。ZEBET的統(tǒng)計學(xué)家開發(fā)了PIF預(yù)測模型，漢堡大學(xué)的Holzhütter等開發(fā)了MPE預(yù)測模型。借助數(shù)據(jù)處理和分析軟件可提高檢測的標準化和效率。3T3-NRU-PT試驗于2004年正式作為指南TG 432發(fā)布，并被EMEA（歐洲藥品管理局）、美國FDA和日本政府認可作為監(jiān)管用途。2008年中國將其轉(zhuǎn)化為國家標準（GB/T21769-2008）并用于化學(xué)品光毒性檢測。
2、聯(lián)合血紅細胞光毒性測試（RBC-PT）
光溶血是一種簡單快速的篩選光敏感物質(zhì)的體外技術(shù)，結(jié)合血紅蛋白氧化可在人體細胞水平上篩選光敏物和研究光毒性作用機制。目前標準化的RBC-PT方法測定紅細胞的兩個終點，即光溶血和甲基化-血紅蛋白（met-Hb）形成，包括光溶血和血紅蛋白光氧化兩個試驗。實驗中將化學(xué)物質(zhì)與紅細胞接觸，暴露于光線一段時間，在525 nm處測定吸光度評價光溶血作用，630nm處測定吸光度評價met-Hb的形成。預(yù)測模型為兩個判定值，通過檢測光溶血因子（PHF）和最大吸光度值來確定化學(xué)物質(zhì)的光毒性。PHF≥3.0判定為光溶血陽性，最大吸光度值(delta)ODmax≥0.05 判定為met-Hb形成陽性。
驗證研究認為，RBC-PT測試與體內(nèi)試驗終點具有良好的一致性，并提供兩種不同類型的光動力學(xué)反應(yīng)機制的信息（甲基化血紅蛋白形成表明I型反應(yīng)，光紅細胞溶血效應(yīng)是原發(fā)性的II型反應(yīng)）。用紅細胞的另一個優(yōu)點是其對太陽光的短波UVB有耐受性，使PBC-PT測試能較長時間地暴露于高劑量的UVB下，以充分獲得光毒性機理的信息。RBC-PT試驗已完成COLIPA/ ECVAM的雙盲測試條件下的預(yù)驗證和驗證，有待被認可為急性光毒性體外測試的標準方法。目前RBC-PT已用于歐洲（德國）、日本的一些實驗室，中國質(zhì)檢和部分從事體外檢測的實驗室也開展此項檢測。
3、人體三維皮膚模型的體外光毒性測試（H3D-PT）
三維重建皮膚模型不僅可替代動物實驗用于皮膚刺激性的檢測，還可用于體外測試替代光毒性動物實驗。3D皮膚模型可從商業(yè)途徑獲得或?qū)嶒炇易灾?，前提是只有嚴格質(zhì)量控制和標準化達到一定程度的模型才能用于體外毒性試驗。以EpiSkinTM皮膚模型為例，該模型由成人角質(zhì)細胞經(jīng)體外培養(yǎng)分化形成多層人體表皮結(jié)構(gòu)。完整的檢測試劑盒包含12個表皮單位、必須培養(yǎng)基和無菌培養(yǎng)板。先將含EpiSkin皮膚的培養(yǎng)置于培養(yǎng)箱中備用。一塊板用于無光照條件下的不同濃度的待測化學(xué)品的測試（類似人工皮膚模型的皮膚刺激試驗），另一板用于有光照條件下的不同濃度的待測化學(xué)品的測試。2h后去除受試物，用無細胞毒性劑量的光線照射2h。最后進行細胞活性測定（MTT法）和IL-1α的測定。如果導(dǎo)致細胞毒性增加25%以上或者IL-1α釋放量之差≥40 pg/ml，則這個化學(xué)物就被預(yù)測為具有光毒性，如果一個化學(xué)物即沒有引起細胞毒性增加25%，也沒有引起 IL1>40pg就被預(yù)測為無光毒性。
H3D-PT法的優(yōu)點在于由于重建皮膚具有代謝活性，因3A7XlTo7wG3X3U5QrMb9uQ==而可以對受試化學(xué)物質(zhì)的生物利用度進行評價。但是對于那些不能通過局部途徑進入皮膚、但通過系統(tǒng)途徑（例如口服或注射暴露）在皮膚具有足夠生物利用度的光毒性物質(zhì)不能檢測，也不能檢測需要重復(fù)暴露后才能造成光變態(tài)反應(yīng)的弱光反應(yīng)化學(xué)物。H3D-PT試驗不能作為評估化學(xué)物光毒性的獨立方法，但可作為3T3-NRU-PT試驗的補充方法。
4、未驗證的替代方法
酵母試驗（yeast assay）：哺乳動物細胞和細菌對于長時間的紫外線特別是UVB暴露過于敏感，限制了其在光毒性和光遺傳毒性試驗中的應(yīng)用。厭氧啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種真核生物，具有對太陽光暴露或水溶性化學(xué)物長時間暴露相對不敏感的優(yōu)點，不管水溶性受試物是油狀還是膏體狀，甚至是氧壓極低的情況（如油狀或奶油狀）都可以檢測。與哺乳動物細胞和其它試驗生物相比，利用啤酒酵母檢測化學(xué)品的光毒性相對簡單和經(jīng)濟，可以快速進行定量和定性檢測。厭氧酵母增殖試驗是基于化學(xué)物質(zhì)與細胞、器官或DNA的光動力學(xué)反應(yīng)，通過比較光照和非光照條件下，檢測與化學(xué)物質(zhì)接觸24h后的細胞增殖率或克隆形成能力來評價光照下化學(xué)物質(zhì)對細胞生長的影響。
光雞胚試驗（photo hen’s egg t
