杉木嫁接產(chǎn)生無性雜種的一個例證

齊 明，何貴平，羅修寶，華朝暉，翁春媚

(1.中國林業(yè)科學研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；2. 浙江省遂昌縣林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 遂昌323300)

杉木嫁接產(chǎn)生無性雜種的一個例證

齊 明1，何貴平1，羅修寶2，華朝暉2，翁春媚2

(1.中國林業(yè)科學研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；2. 浙江省遂昌縣林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 遂昌323300)

浙江省遂昌縣杉木雙系種子園七小區(qū)1339嫁接無性系，其穗條來源于浙江省余杭長樂杉木種子園。針對雙七區(qū)1339無性系的眾多接株個體間變異明顯，以其余杭長樂杉木種子園中的1339正常株作對照，分析兩者在形態(tài)、花期、花量和等位酶等特性上的差異性和相似性。結(jié)果證明：異常1339植株應(yīng)為無性雜種。由此得到一些啟示：(1)采用分子標記技術(shù)，構(gòu)建種子園無性系的指紋圖譜時，將相差1-2條譜帶的材料劃分為兩個無性系時，要特別小心；因為這樣做可能是錯的。(2)在林木種子園、采穗圃或基因庫建立時，最好采用同一無性系材料來做砧木；在困難條件下，用同一家系苗來作砧木也行，這可保證穗條接受相同的遺傳因子影響。(3)對林木嫁接種子園中不同無性系的生長量，開花結(jié)實量等特性的評估時，應(yīng)考慮到無性雜交這一因素造成的影響，因為不同砧木的遺傳背景不同，產(chǎn)生的影響也會不同。

杉木；嫁接；無性雜交；無性雜種；例證；啟示

數(shù)量遺傳學告訴我們：任何一個性狀的表型都是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，即一個性狀的表型值=遺傳因子+環(huán)境因子+遺傳因子×環(huán)境因子互作綜合作用的結(jié)果。分子遺傳學告訴我們：表型性狀是由基因支配的，DNA是基因的遺傳物質(zhì)，并攜帶遺傳信息，基因是遺傳信息的物理單位和功能單位。但是基因的表達與否是由環(huán)境因子決定的，即環(huán)境因子可開啟或關(guān)閉基因的表達，而基因表達又會影響有機體的內(nèi)環(huán)境，同時同一基因型，在不同的(外、內(nèi))環(huán)境中，可能會出現(xiàn)不同的表型。由此可見，在性狀的遺傳變異方面，數(shù)量遺傳學與分子遺傳學的原理是一致的。長期以來學術(shù)界有關(guān)控制性狀遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的爭論，最終以“米丘林學派”的失敗，以“摩爾根學派”取得了勝利而告結(jié)束。

但是作為一個有良知的科學工作者，應(yīng)以追求真理為自己的終身職責。不少人認為米丘林學說中有些學術(shù)思想是正確的，對于這些正確的觀點應(yīng)該放在一正確的位置。例如：在園藝作物中無性雜交是普遍存在的，在不少園藝學家，至今將其作為一種重要的育種手段，并取得巨大成績[1-6]。但在用材林的遺傳育種中，無性雜交現(xiàn)象尚引起人們的注意。在此報道一例杉木嫁接種子園中存在無性雜交的事實，以期引起同行們的的注意，更好地為林木有性育種服務(wù)。

嫁接又叫無性雜交，是將甲植株(穗條)嫁接到乙植株(砧木)上，植物進行嫁接時，由于砧木和接穗流質(zhì)的相互影響，可以產(chǎn)生無性雜種。因嫁接能使穗條(或砧木)的遺傳特性發(fā)生改變，因此無性雜交是改變有機體遺傳性的極有效的方法[3]，人們或利用砧木對接穗的影響；或利用接穗對砧木的影響來選育無性雜種。來自維普和萬方網(wǎng)站的信息，時至目前，我國已在園藝作物、經(jīng)濟作物以及疏菜作物中，無性雜交育種取得了巨大成績，培育出了不少優(yōu)品種。但是在林木遺傳育種中，無性雜交(即嫁接)會產(chǎn)生無性雜種這一現(xiàn)象尚未引起育種工作者的注意，因為無性雜交不利于種子園、基因庫、采穗圃中優(yōu)良品種遺傳特性的保持與穩(wěn)定。

時至目前，國內(nèi)以自根苗為參照對象，對無性雜交苗進行了多方面的研究：研究砧木或穗條對無性雜種的影響，從形態(tài)、生長、結(jié)實、生化特性，根系生長與分布、根際微生物種群變化等方面的相互影響，無性雜種優(yōu)勢產(chǎn)生的機制，到雜種的化學生態(tài)學研究等[8-25]， 目前現(xiàn)代分子生物學的研究則揭示出：參與嫁接的砧木與穗條間存在基因相互交流，從而使穗條(或砧木)的遺傳性發(fā)生一定的改變，正是這種相互影響改變了原株的遺傳特性[5-6]。由于在林木中仍在廣泛地采用嫁接技術(shù)，杉木造林用種大部分來自嫁接種子園，種子園中會發(fā)生無性雜交，其影響應(yīng)引起人們的注意。本研究報道了杉木嫁接種子園中，無性雜交產(chǎn)生無性雜種的事實，以期為林木育種服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究材料是浙江遂昌縣嫁接雙系種子園第七區(qū)的建園材料，該雙系種子園的兩個無性系是1339和1366，穗條均來自浙江省余杭長樂林場初級嫁接種子園。遂昌雙系種子園中接株采用嫁接方法來完成，目前早以投產(chǎn)。由于不同砧木的遺傳背景不同，嫁接后1339無性系部分接株(約45%)在若干特性上，彼此產(chǎn)生了明顯的變異，這使人懷疑是嫁接時穗條搞錯了。齊明等人不同意這一觀點，因為穗條錯用不可能有如此大的比率。故展開了如下研究，以正常株為對照進行對比研究，論證變異株即為無性雜種。

1.2 研究方法

(1)以1339正常接株為參比對象，研究正常1339與變異1339在若干形態(tài)習性方面的差異大??；(2)以1339正常接株為參比對象，研究正常1339與變異1339在開花結(jié)實習性方面的差異大小；(3)以1339正常接株為參比對象，兩種類型1339，各取數(shù)粒發(fā)芽種子的胚或胚乳/胚，采用PAGE等位酶技術(shù)，研究正常1339與變異1339，在蘋果酸脫氫酶(MDH,EC.1.1.1.37); 蘋果酸酶(ME,E.C.1.1.1.40);谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT,EC.2.6.1.1);甲酸脫氫酶(FDH,EC.1.2.1.2)和乳酸脫氫酶(LDH，E.C.1.1.1.27)5種等位酶方面的差異性和相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常1339接株與變異1339接株在若干形態(tài)習性方面的差異大小

通過對余杭長樂林場杉木初級種子園中的1339無性系的觀察分析，指定雙七區(qū)中一種類型1339為正常接株，另一類的1339接株為變異株，整個雙七區(qū)中1339大約45%的接株產(chǎn)生了明顯的變異。

在形態(tài)方面，正常的1339接株葉色為青枝杉，側(cè)枝分枝略稀而粗；而變異的1339接株枝葉雖亦為青枝杉，但分枝細密。

2.2 正常1339接株與變異1339接株在開花結(jié)實習性方面方面的差異大小

通過對遂昌杉木雙系種子園七區(qū)中的無性系進行花期觀察分析時，發(fā)現(xiàn)雙系種子園中的1339無性系正常株與變異株亦存在明顯的變異。它們從球果大小、多少、花期早晚等方面，都存在著明顯的差異：

在開花結(jié)實習性方面，正常的1339接株的雌花數(shù)量中等多少，但球果較大，其雄花略偏多，雌雄球的開花期也較變異株1339接株早；而變異株1339接株，雌球花細且多，明顯偏雌，集中成簇，雄花開放較正常1339晚。

2.3 兩類植株在等位酶方面方面的差異性和相似性

以上描述了正常的1339接株和變異1339接株,在形態(tài)及開花結(jié)實方面存在明顯的差異,下面論述其等位酶分析的結(jié)果。采用PAGE同工酶技術(shù)，對正常的1339接株和變異1339接株進行基因型分析，先經(jīng)過預備試驗，從在20個酶系統(tǒng)中，篩選出5種等位酶系統(tǒng)。它們是蘋果酸脫氫酶(MDH,EC.1.1.1.37); 蘋 果 酸 酶 (ME,E.C.1.1.1.40)；谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT,EC.2.6.1.1);甲酸脫氫酶(FDH,EC.1.2.1.2)和乳酸脫氫酶(LDH，E.C.1.1.1.27)。經(jīng)同工酶實驗，發(fā)現(xiàn)1339無性系兩種類型，在蘋果酸脫氫酶(MDH,EC.1.1.1.37); 蘋果酸酶(ME,E.C.1.1.1.40)；甲酸脫氫酶(FDH,EC.1.2.1.2)和乳酸脫氫酶(LDH，E.C.1.1.1.27) ， 4種酶系統(tǒng)上，它們的圖譜完全一致，即在這4種酶系統(tǒng)上，兩種類型的1339具有相同的遺傳結(jié)構(gòu)。僅在谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶系統(tǒng)上，兩者存在明顯的差異：正常接株1339胚的GOT的分析結(jié)果是，3個等位酶位點只有一個位點(GOT-1)是雜合的，另外兩個位點(GOT-2/GOT-3)是純合的；而變異株1339胚乳/胚GOT的分析結(jié)果是，三個等位酶位點卻有2個位點(GOT-1/GOT-2)是雜合，僅GOT-3是純合的，再用發(fā)芽種子，重復一次GOT同工酶實驗，獲得的結(jié)果與上次分析結(jié)果完全相同。為了節(jié)約篇幅，突出重點，PAGE等位酶的圖譜，僅提供谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT,EC.2.6.1.1)的實驗結(jié)果，見圖1、2。

圖1 正常1339無性系11粒胚乳GOT電泳示意(GOT是2個等位基因編碼的二聚體)Fig.1 Got electrophoresis diagram of nomoral 1339 clone at embryos (Got is dimmer encoding by 2 alleles)

圖2 變異株1339無性系6粒胚乳/胚GOT電泳(GOT是2個等位基因編碼的二聚體)Fig. 2 Electrophoretogram of six endosperm and embryo dimmers of grafting clone 1339’s variant

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)果分析與討論

正常的1339接株和變異1339接株,在形態(tài)及開花結(jié)實方面存在明顯的差異,是乎是兩個無性系，但是等位酶的分析結(jié)果，則反應(yīng)正常的1339接株和變異1339接株在遺傳結(jié)構(gòu)上差異很小，兩者具有很大的相似性，因此這種變異接株應(yīng)為1339的無性雜種。

這里須說明的是，其一，兩類1339中還存在微變異，如針葉的堅挺或柔軟等等；其二嫁接也使其它無性系的接穗產(chǎn)生了變異，如雙七區(qū)另一無性系1366中，也有一小小部分接株在針葉形態(tài)(氣孔線明顯否)，雄花體積大小和數(shù)量的多少等方面產(chǎn)生的變異,因1366無性雜種發(fā)生比率太低(目測約1%)，故本研究僅對1339無性雜交的情形展開分析研究。

關(guān)于遂昌縣雙系種子園中1339產(chǎn)生變異接株這一現(xiàn)象，以前生理學的研究認為，砧木向接穗轉(zhuǎn)移了諸如促進細胞分裂素類等物質(zhì)，從而促進了接穗的枝葉等性狀的細胞分裂；同樣接穗也會向砧木轉(zhuǎn)移了諸如生長素等物質(zhì)，從而促進了根系性狀性的生長。現(xiàn)代分子遺傳學的研究結(jié)果表明，在植物嫁接植株中，砧木與接穗間進行了基因交流。在遂昌雙系種子園中，有些1339的穗條與砧木發(fā)生了無性雜交，那種變異株即為無性雜種。

以上研究表明，在林木中嫁接使接穗與砧木間可能發(fā)生無性雜交。但從杉木大量的嫁接試驗結(jié)果看來，無性雜交發(fā)生頻率較低，無性雜種優(yōu)勢的方向具有不確定性，無法預測。采用有性雜交的方式來選育新品種仍是首選的育種方法。

3.2 結(jié) 論

通過以上觀察分析，發(fā)現(xiàn)1339正常株與異常株在表型上存在較大的差異，但是同工酶分析的結(jié)果，揭示出其基因型的遺傳結(jié)構(gòu)還是比較相近的。因為5個酶系統(tǒng)中，僅GOT三個位點中的一個位點由純合變成了雜合。這符合無性雜交的原理。

杉木嫁接可以產(chǎn)生無性雜種,這對有性育種會產(chǎn)生許多影響,并給我們帶來許多啟示:

(1)采用分子分子標記技術(shù)，構(gòu)建無性系的指紋圖譜時，將種子園中差異相差1-2條譜帶的材料劃分為兩個無性系時，要特別小心；因為這樣做可能是錯的。

(2)在林木種子園、采穗圃或基因庫建立時，最好采用同一無性系材料來做砧木，在困難條件下，用同一家系苗來作砧木也行，這可保持穗條接受相同砧木遺傳因子的影響。

(3)由于在杉木中存在無性雜交的產(chǎn)物，無性雜交產(chǎn)生的雜種，其后果具有的隨機性和不可預測性，因此在杉木中無性雜交對杉木的良種選育一時沒有指導作用。

(4)對林木嫁接種子園中不同無性系的生長量，結(jié)實量等特性的評估時，應(yīng)考慮到無性雜交這一因素造成的影響，因為不同砧木的遺傳背景不同。

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An asexual hybrid generating from Chinese fir grafting clones in Suichang of Zhejiang province

QI ming1, HE Gui-ping1, LUO Xiu-bao2, HUA Chao-hui2, WENG Chun-mei2
(1. Subtropical Forestry Institute, Chinese Academy of Forestry, Fuyang311400, China 2. Suichang Forestry Bureau of Zhejiang, Suichang 323300, China )

The grafting clone 1339 grew in the seventh plot of biclonal seed orchard in Suichang County of the Zhejiang province,their cuttings were taken from the Changle Chinese fir seed orchard in Yuhang,and there were distinct variables among the individuals.Compared the grafted clone 1339 in Suichang orchard with the clone 1339 in the Changle orchard, it was found that there were obvious diversity and similarity in aspects of morphology,flowering period,flower amount and allozyme between the two clones. The results confirm that the grafted clone 1339 having eхceptionally characteristics should be a kind of aseхual hybrid. Furthermore, we can get some implications: (1) when using the molecular marker technique, constructiog clone fingerprint, and dividing materials with the difference of 1-2 bands into two clones, we must be specially careful, because this result possibly a wrong outcome. (2) when establishing, tree graft seed orchard, cutting orchard or gene bank, we should better use the identical clone material to make the stock;under the difficult condition, maybe makes same family seedling use stocks .This may maintain cutting-strips to accept the same genetic influence. (3) when evaluating the growth quantity, flowering and seed-bearing yield of different grafting clones, the influence of aseхual hybridization on cutting-strips should be considered because the stocks are different sources, the different stock’s genetic background will produce different genetic effects.

Chinese fir;graft; aseхual hybridization; vegetative hybrid; eхemplification;enlightenment

2011-04-14

浙江省林業(yè)廳與中國林科院合作項目”杉木高世代育種群體建立和優(yōu)質(zhì)速生新品種選育(2007SY09)；浙江省科技廳重大項目“優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹種新品種創(chuàng)制及高效培育關(guān)鍵技術(shù)研究與示范(2008C2004-2)

齊 明(1962—)，男，湖北省武漢人，副研究員，從事林木多性狀遺傳改良研究；E-mail: Qiwater03@sina.com

S791.27

A

1673-923X(2012)02-0056-04

[本文編校:文鳳鳴]