巨桉無性系Eg5的卡那霉素和頭孢霉素敏感性研究

郭利軍，曾炳山，劉 英，李湘陽，裘珍飛

巨桉無性系Eg5的卡那霉素和頭孢霉素敏感性研究

郭利軍，曾炳山，劉 英，李湘陽，裘珍飛

(中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所 廣東廣州 510520)

以巨桉無性系Eg5葉片為外植體材料，試驗了硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate，Km)對外植體愈傷組織誘導增殖、芽分化、芽生根的影響，并且試驗了頭孢霉素(Cefotaxime，Cef)對外植體再生的影響及其對根癌農(nóng)桿菌GV3101的抑制效果。結(jié)果表明：抑制愈傷組織增殖培養(yǎng)的卡那霉素濃度為17.5 mg/L，完全抑制芽分化的卡那霉素濃度為60 mg/L，完全抑制生根的卡那霉素濃度為400 mg/L；Cef在0～500mg/L范圍內(nèi)，0～300 mg/L Cef對外植體的生長分化影響最??；共培養(yǎng)結(jié)束后的外植體經(jīng)過500 mg/L的Cef處理后，共培養(yǎng)基中添加100 mg/L的Cef便可以完全抑制農(nóng)桿菌GV3101的生長。

桉樹；Eg5；抗生素；根癌農(nóng)桿菌；敏感性

Eg5是優(yōu)良的巨桉Euclyptus grandis W.Hill ex Maiden無性系，具有速生、干形通直、分枝角度小、出材率高等特點，在我國江西南部、湖南南部、福建中部等南亞熱帶地區(qū)已廣泛栽培，但巨桉Eg5也存在青枯病抗性較低、冰凍抗性較低等問題[1-2]。通過根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化可以將抗病、抗寒等目的基因轉(zhuǎn)入巨桉基因組中，改良上述不良性狀，這是一種非常有潛力的基因工程育種辦法。農(nóng)桿菌進行遺傳轉(zhuǎn)化過程中，為了能夠篩選出轉(zhuǎn)化細胞，通常會在轉(zhuǎn)化過程中加入一定濃度的卡那霉素等氨基糖苷類抗生素抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長。外植體共培養(yǎng)結(jié)束后，為了清除農(nóng)桿菌，會在培養(yǎng)基中加入適量的頭孢霉素或羧芐青霉素等抗生素來抑制農(nóng)桿菌的生長[3-4]。為了開展Eg5的轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎，以Eg5組培苗的葉片為外植體材料，研究了硫酸卡那霉素對愈傷組織增殖、芽分化和生根的影響以及頭孢霉素對農(nóng)桿菌GV3101的抑制效果和對再生的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以生根培養(yǎng)45 d左右的Eg5無菌生根苗為試驗材料，選取頂端完全展開的1～4片帶葉柄的葉片為外植體，剪去占全葉1/3長度的葉尖部分?？敲顾?Km)和頭孢霉素(Cef)均購自鼎國生物技術有限公司。

1.2 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

愈傷組織再生培養(yǎng)基為改良MS+TDZ 0.12 mg/L+NAA 0.25 mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂6 g/L，pH 5.6；芽伸長培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.05 mg/L+IAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L +卡拉膠 7 g/L，pH 5.6；生根培養(yǎng)基為改良MS+NAA 0.4 mg/L+IBA 0.8 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠7 g/L+活性炭0.1 g/L，pH 5.6；培養(yǎng)基在0.11 MPa高壓下，121 ℃滅菌17 min，冷卻至50 ℃后加入相應的抗生素。培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，先進行10 d的暗培養(yǎng)處理，然后在1 500 lx光照強度下培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 卡那霉素對愈傷組織誘導增殖的影響試驗

將切好的葉片接種在含Km質(zhì)量濃度為0、5、10、15、17.5 mg/L的再生培養(yǎng)基中進行愈傷誘導及增殖試驗，所有Km處理的培養(yǎng)基均添加了100 mg/L的Cef，對照培養(yǎng)基則不添Km和Cef，培養(yǎng)4周后稱量愈傷的重量。每個處理5瓶，每瓶6個外植體，重復3次。

1.3.2 卡那霉素對愈傷組織芽分化的影響試驗

將切好的葉片接種到不含任何抗生素的再生培養(yǎng)基上，兩2周繼代一次，培養(yǎng)4周后將愈傷組織接種到含Km質(zhì)量濃度為20、30、40、50、60、80、100 mg/L的再生培養(yǎng)基中，2周后統(tǒng)計再生外植體的個數(shù)；以不加Km培養(yǎng)基為對照，每個處理5瓶，每瓶5個外植體，重復3次。

1.3.3 卡那霉素對芽生根的影響試驗

切取長度約2 cm的芽，接種在含Km質(zhì)量濃度為100、200、300、400 mg/L的生根培養(yǎng)基中，4周后統(tǒng)計生根株數(shù)。以不加Km培養(yǎng)基為對照，每個處理15株，重復15次。

1.3.4 頭孢霉素對葉片再生的影響試驗

將切好的葉片接種在含Cef質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500 mg/L的再生培養(yǎng)基上，兩周繼代培養(yǎng)1次，培養(yǎng)約4周，待愈傷組織冒出綠色點狀芽，即轉(zhuǎn)入含有與上述Cef濃度相同的芽伸長培養(yǎng)基中，2周后統(tǒng)計再生率、每外植體上最大芽長和高于1 mm芽的數(shù)量。以不加Cef培養(yǎng)基為對照，每個處理5瓶，每瓶6個外植體，重復3次。

1.3.5 頭孢霉素抑菌效果試驗

取-75℃凍存的根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，在冰上解凍后劃平板活化培養(yǎng)3 d。挑取單菌落于4 mL液體LB培養(yǎng)基中180 r/min過夜培養(yǎng)，當菌液OD600值達到0.2后，按照1∶40比例接入新鮮LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.5，4 000 r/min離心8 min，用等量的液體再生培養(yǎng)基重懸菌體，再將切好的葉片放入侵染液中，置于85 r/min的搖床上侵染1 h；共培養(yǎng)1 d后取出共培養(yǎng)的外植體，放入含有500 mg/L Cef的液體再生培養(yǎng)基中[5-7]，輕輕搖動2小時，用無菌水漂洗3次轉(zhuǎn)接到含有Cef濃度為100、200、300、400、500 mg/L的再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4周，每日觀察有無農(nóng)桿菌長出，以不加Cef為對照，每個處理10瓶，每瓶6個外植體。

1.4 統(tǒng)計分析

所有百分數(shù)經(jīng)平方根反正弦化ASIN(SQRT(X))、個數(shù)經(jīng)平方根轉(zhuǎn)化SQRT(X)，采用SPSS分析軟件進行方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較(P=0.05)。文中數(shù)據(jù)為未轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸卡那霉素對愈傷組織誘導增殖的影響

Km可對正常植物細胞中70 s核糖體功能產(chǎn)生抑制，使葉綠體不能正常發(fā)育，導致植物產(chǎn)生白化現(xiàn)象，能有效抑制正常植物細胞的分化[8]。通過分析添加Km對愈傷組織重量大小的影響，了獲得愈傷組織增殖培養(yǎng)階段Km的適宜質(zhì)量濃度。從表1可以看出，隨著Km質(zhì)量濃度的提高，Km抑制愈傷組織增殖生長越明顯。通過多重比較分析，各處理間Km質(zhì)量濃度17.5與0、5、10、15 mg/L存在顯著差異，而Km質(zhì)量濃度為0、5、10、15 mg/L各處理間沒有顯著差異，說明Km質(zhì)量濃度為17.5 mg/L是抑制細胞愈傷組織增殖培養(yǎng)的臨界質(zhì)量濃度。

表1 卡那霉素對巨桉Eg5愈傷組織誘導增殖的影響?Table 1 Effect of Kanamycin on callus induction and proliferation of E.grandis clone Eg5

2.2 硫酸卡那霉素對愈傷組織芽分化的影響

與愈傷組織芽分化階段相比，增殖階段的Km抗性有所增強，因此需要添加的濃度明顯提高。隨著Km濃度的提高再生率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢（表2），當Km濃度在20～40 mg/L之間時，再生率范圍為11.11%～16.67%，芽有輕微失綠現(xiàn)象，當Km提高至50 mg/L時再生率下降至9.16%，且再生芽不能伸長，葉片白化現(xiàn)象明顯；當Km質(zhì)量濃度大于60 mg/L時再生率下降為0，由于較高的Km濃度可能會造成轉(zhuǎn)化芽的無法繼續(xù)生長，所以愈傷組織芽分化階段轉(zhuǎn)化芽適宜的Km篩選濃度應為60 mg/L。

表2 卡那霉素對巨桉Eg5愈傷組織芽分化的影響?Table 2 Effect of Kanamycin on bud differentiation of E.grandis clone Eg5

2.3 硫酸卡那霉素對芽生根的影響

生根階段芽的Km抗性大大增強，筆者在預實驗中發(fā)現(xiàn)250 mg/L的Km根本不足以完全抑制生根。由表3可以看出，隨著Km的增加，生根率及高于2.5 cm苗的百分率均逐漸降低至0。Km達到200 mg/L時，與對照及Km100 mg/L相比再生率及高于2.5 cm苗百分率均顯著下降，分別僅有18.64%和7.60%，Km達到300 mg/L時，生根率急劇降至1.33%，高于2.5 cm苗百分率也降至1.78%，Km達到400 mg/L時已經(jīng)完全抑制了芽的生根，未見高于2.5 cm的苗；Km達到200 mg/L時，與對照及Km100 mg/L相比生根苗葉片變小，株型細小，黃化嚴重；Km達到300 mg/L時，單株生長緩慢，白化植株比例變大，植株生長極其緩慢，但仍存在少量單株生長狀況較好；Km達到400 mg/L時，單株葉片萎蔫，大部分植株褐化，未見生長。所以，生根階段適宜篩選的Km的質(zhì)量濃度為400 mg/L。

表3 卡那霉素對巨桉Eg5芽生根的影響?Table 3 Effect of Kanamycin on shoot rooting of E.grandis clone Eg5

2.4 頭孢霉素對葉片再生的影響

抗生素的添加應能抑制農(nóng)桿菌的生長，但又盡可能不對愈傷組織的正常生長和分化產(chǎn)生顯著影響。為了防止農(nóng)桿菌的過度生長影響外植體的愈傷生長及分化，本實驗采用Cef抑制農(nóng)桿菌生長，但過高的Cef濃度會影響外植體的生長和分化[3-4]，因此研究不同濃度的Cef濃度對再生的影響對于提高遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要的意義。

從表4中可以看出，Cef濃度在0～500 mg/L以內(nèi)，對再生率影響較小，再生率范圍在73.07%～84.44%之間，100 mg/L的Cef還提高了再生率，達到84.44%，但芽的高生長卻受到了抑制，每個外植體分化芽的數(shù)量也減少；當Cef濃度達到200～300 mg/L時，高于1 mm芽數(shù)又明顯低于100 mg/L，Cef濃度達到400～500 mg/L時，高于1 mm芽數(shù)達到最少；Cef濃度為0～300 mg/L時最大芽高無顯著差異，單芽高維持在0.39～0.70 cm之間，達到400 mg/L時最大芽高開始明顯低于對照，下降至0.23 cm，Cef達到500 mg/L時最大芽高下降至最低。綜上所述，0～300 mg/L Cef對外植體的生長分化影響最小。

表4 頭孢霉素對巨桉Eg5葉片再生的影響?Table 4 Effect of Cefotaxime on bud regeneration from leaves of E.grandis clone Eg5

2.5 頭孢霉素的抑菌效果

Cef屬于β-半乳糖苷酶抑制型抗生素，可以抑制肽聚糖鏈的交聯(lián)，從而干擾農(nóng)桿菌細胞壁的形成，阻止其生長[9]。本研究采用培養(yǎng)基中加入Cef方式進行抑菌實驗，以確定合適的使用濃度。

由表5可知，低濃度的Cef就可以很好的抑制農(nóng)桿菌的生長，當Cef濃度≥100 mg/L時已經(jīng)完全抑制了農(nóng)桿菌的生長，所以對于根癌農(nóng)桿菌GV3101介導的巨桉EG5遺傳轉(zhuǎn)化適宜的頭孢霉素抑菌Cef濃度為100 mg/L。

表5 頭孢霉素對根癌農(nóng)桿菌介導巨桉Eg5葉片轉(zhuǎn)化的抑菌效果?Table 5 Inhibition effects of Cefotaxime on Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation on leaves of E.grandis clone Eg5

3 結(jié)論與討論

卡那霉素作為一種氨基糖苷類抗生素，可抑制植物葉綠體蛋白質(zhì)的合成，被廣泛用于轉(zhuǎn)化細胞的篩選工作。在黑胡桃木、李子、白楊、赤桉、尾巨桉、藍桉等許多樹種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卡那霉素可以顯著抑制外植體的形態(tài)發(fā)生[10-17]。本研究也表明Eg5葉片愈傷組織生長、芽再生及生根能力均隨著卡那霉素濃度的增加而逐漸下降，白化現(xiàn)象逐漸加重；研究中發(fā)現(xiàn)卡那霉素在Eg5葉片轉(zhuǎn)化芽篩選階段濃度達到了60 mg/L，高出巨桉Eg8和C101莖段[18]篩選濃度一倍，也明顯高于赤桉子葉及下胚軸篩選濃度的40 mg/L和9 mg/L[13-14]，及尾巨桉莖段和下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化研究中75 mg/L和40 mg/L[15-16]的濃度值，造成此現(xiàn)象的原因可能是不同桉樹樹種不同外植體對卡那霉素的本底抗性各不相同，以上也說明巨桉Eg5葉片與其它桉樹樹種外植體相比有著較高的卡那霉素本底抗性。

席夢利在做杉木莖段轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化芽篩選階段卡那霉素濃度達到了40 mg/L，生根階段卡那霉素篩選濃度降低為8 mg/L[19]；尾葉桉的轉(zhuǎn)化研究表明40 mg/L的卡那霉素明顯抑制了葉盤的分化，20 mg/L的卡那霉素則完全抑制了再生植株的生根[20]，尾巨桉、粗枝木麻黃、銀白楊等[21-23]生根篩選濃度從40 mg/L到100 mg/L不等，巨桉Eg5生根階段卡那霉素抗性顯著增強，卡那霉素濃度達到400 mg/L時才能完全抑制生根，與上述生根篩選濃度相比高出了3～49倍，可能有以下原因：(1)由樹種本身的特性所決定，巨桉Eg5具有較高的卡那霉素本底抗性；(2)生根培養(yǎng)基中由于添加了活性炭，對卡那霉素有較強的吸附作用；(3)培養(yǎng)基中由于有促進生根的NAA及生根粉等物質(zhì)，可能很大程度上抵消了卡那霉素對生根的抑制作用。造成巨桉生根階段卡那霉素篩選濃度較高的原因尚無法確定，上述哪一方面或是幾個方面共同起了作用還有待進一步的研究。

頭孢霉素是農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化實驗中常用的抑菌抗生素，許多研究表明頭孢霉素對外植體的分化有毒害作用[24-26]，但也有相關研究表明適量的頭孢霉素對外植體的分化存在促進作用。Lin J.J.等[27]曾報道羧芐青霉素和頭孢霉素等與生長素2,4-D、NAA等有相似的化學結(jié)構(gòu)，適當濃度的該類抗生素能促進愈傷組織的分化與生長，小麥的抗生素研究[3]也發(fā)現(xiàn)100 mg/L的頭孢霉素可以改善愈傷的生長、形態(tài)發(fā)生及器官發(fā)生且明顯提高了再生率，Yepes L.M[28]做了7個蘋果品種的抗生素實驗，發(fā)現(xiàn)250 mg/L的頭孢霉素顯著提高了再生率。本研究也表明，100 mg/L頭孢霉素可以提高葉片的再生率，這與James D.J.等[29]和Maheswaran G.等[30]所提出的低濃度的頭孢霉素對外植體的再生有促進作用的結(jié)論相一致。當頭孢霉素達到500 mg/L時，本研究發(fā)現(xiàn)巨桉的再生率下降不明顯，Yepes L.M[28]發(fā)現(xiàn)蘋果再生率卻下降了40%～70%，其原因可能是蘋果的頭孢霉素適應范圍較小，而巨桉適應范圍較大所致。

頭孢霉素的抑菌效果與農(nóng)桿菌菌株的類型有關[7]，研究表明，共培養(yǎng)結(jié)束后的外植體經(jīng)過500 mg/L的頭孢霉素處理后，共培養(yǎng)基中添加100 mg/L的頭孢霉素便可以完全抑制農(nóng)桿菌GV3101的生長，頭孢霉素對C58C1、LBA4404、EHA105等其它菌株的抑菌效果及頭孢霉素最佳的抑菌濃度還有待于進一步研究。

本研究表明，巨桉Eg5葉片外植體在不同生長分化階段對卡那霉素的抗性也是不同的，建議研究人員在以后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究中，根據(jù)樹種、外植體類型及其生長階段的不同研究相應的卡那霉素濃度篩選轉(zhuǎn)化細胞。

[1] 曹季丹,沈文生,潘月芳.蝴蝶果青枯病研究初報[J].廣西林業(yè)科學 ,1980,(1)：36-37.

[2] 林 平.永安桉樹造林及其凍害情況調(diào)查[J].桉樹科技，2001,(1)：l5-20.

[3] Mathias R J, Boyd L A.Ceftaxime stimulates callus growth,embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat(Triticum aestivum L)[J].Plant Science,1986, 46(3)：217-223.

[4] Nauerby B, Billing K, Wyndaele R, et al.Influence of the antibiotic timentin on plant regeneration compared to carbenicilln and cefotaxime in concentrations suitable for elimination of Agrobacterium tumfaciens[J].Plant Science,1997,123：169-177.

[5] Khan M, Robin A, Nazim-Ud-Dowla M, et al.Agrobacterium mediated genetic transformation of two varieties of Brassica：optimization of protocol[J].Bangladesh Journal of Agril.Res.,2009, 34(2)：287-301.

[6] Spokevicius A V, Beveren K V, Leitch M A, et al.Agrobacterium mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts[J].Plant Cell Reports,2005, 23：617-624.

[7] 王關林,方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學出版社，2002：1-886.

[8] 曲冠證.小黑楊單倍體耐鹽基因(Bet-A)遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2002：24-25.

[9] 姜清彬.細枝木麻黃再生體系及農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].北京：中國林業(yè)科學研究院，2011：51-52.

[10] Michael J B, Gurpreet S S, Charles H M.Genetic transformation of Black Walnut (Juglans nigra)[J].Gen.Tech.Rep.， 2004,243：45-58.

[11] Gonzalez-Padilla I M, Webb K, Scorza R.Early antibiotic selection and efficient rooting and acclimatization improve the production of transgenic plum plants(Prunus domestica L.)[J].Plant Cell Reports，2003, 22：38-45.

[12] Confalonieri M, Belenghi B, Balestrazzi A, et al.Transformation of elite white poplar (Populus alba L.cv.“Vilafranca”)and evaluation of herbicide resistance[J].Plant Cell Reports,2000,19：978-982.

[13] Quisen R, Oliveira Y D, Pileggi M, et al.Selective agent and A.tumefaciens overgrowth-control antibiotics in Eucalyptus camaldulensis Cotiledonary culture[J].Brazilian Archives of Biology and Technology, 2009, 52：1485-1492.

[14] Ho C K, Chang S H, Tsay J Y.et al.Agrobacterium tumefaciens mediated Transformation of Eucalyptus camaldulensis and production of transgenic plants[J].Plant Cell Reports,1998,17：675-680.

[15] 賴家業(yè), 石海明, 劉 凱, 等.尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立的研究[J].四川大學學報,2007, (2)：415-419.

[16] Chen Z, Tsay J, Chung J.Callus culture of Eucalyptus grandis×urophylla and preliminary studies on organogenesis and Agrobacterium mediated transformation[J].Taiwan Journal of Forest Science,1996, 11(1)：43-52.

[17] Moralejo M, Rochange F, Boudet A M, et al.Generation of transgenic Eucalyptus globulus plantlets through Agrobacterium tumefaciens mediated transformation[J].Australian Journal of Plant Physiology,1998, 25(2)：207-212.

[18] Yao J L, Wang K L.Eucalyptus transformation method[P].US2005/0086714A1, April.21,2005.

[19] 席夢利.杉木轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)的建立及遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].南京：南京林業(yè)大學,2004：68-70.

[20] 孔 華, 郭安平, 郭運玲,等.尾葉桉U6遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立[J].熱帶作物學報,2008,29(4)：424-429.

[21] Tournier V, Grat S, Marque C, et al.An efficient procedure to stably introduce genes into an economically important pulp tree(Eucalyptus grandis×Eucalyptus urophylla)[J].Transgenic Research,2003, 12：403-411.

[22] Lea Q V, Bogusza D, Gherbia H, et al.Agrobacterium tumefaciens gene transfer to Casuarina glauca, a tropical nitrogen-fixing tree[J].Plant Science，1996, 118(1)：57-69.

[23] 李 慧, 陳曉陽, 李 云,等.銀白楊遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素濃度優(yōu)化的研究[J].北京林業(yè)大學學報， 2005, 27(5)：118-121.

[24] Hanhineva K J, Karenlampi S O.Production of transgenic strawberries by temporary immersion bioreactor system and verification by TAIL-PCR[J].BMC Biotechnology,2007, 7(11)：1-12.

[25] 張海平.棉花轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化和抗黃萎病基因的轉(zhuǎn)化[D].杭州：浙江大學,2008：73-74.

[26] 范春節(jié).尾赤桉再生體系及農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因體系研究[D].北京：中國林業(yè)科學研究院.2008, 48-51.

[27] Lin J J, Assad-Garcia N, Kuo J.Plant hormone effect of antibiotics on the transformation efficiency of plant tissues by Agrobacterium tumefaciens cells[J].Plant Science, 1995,109：171-l77.

[28] Yepes L M, Aldwinckle H S.Factors that affect leaf regeneration efficiency in apple and effect of antibiotics in morphogenesis[J].Plant Cell Tissue and Organ culture,1994,37：257-269.

[29] James D J, Passey A J, Barbara D J.Agrobacterium mediated transformation of apple and strawberry using disarmed Ti-binary vectors[J].Acta Horticulturae,1989, 280：495-502.

[30] Maheswaran G, Welander M, Hutchinson J F, et al.Transformation of apple rootstock M26 with Agrobacterium tumefaciens[J].Journal of Plant Physiology,1991, 139(5)：560-568.

Study on kanamycin and cefotaxime sensitivity of Eucalyptus grandis clone Eg5

GUO Li-jun, ZENG Bing-shan, LIU Ying, LI Xiang-yang, QIU Zhen-fei
(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry,Guagnzhou 510520,Huangdong, China)

By taking Eucalyptus grandis colne Eg5 leaves as explants, the effects of Kanamycin sulfate on the callus proliferation, bud differentiation and shoot rooting of leaf explants of Eucalyptus grandis clone Eg5 and the effect of Cefotaxime on explant’s regeneration and the growth of Agrobacterium tumefaciens GV3101 were studied.The results showed that the concentration of kanamycin for restraining callus proliferation was 17.5 mg/L, that for fully suppressing bud differentiation was 60 mg/L and that for inhibiting shoots rooting was 400 mg/L.Cefotaxime at a dosage from 0 mg/L to 300 mg/L had minimal impact on the differentiation of leaf explants.With a soak of the explants in the solution of 500 mg/L Cefotaxime, the growth of agrobacterium can be fully inhibited at a Cefotaxime dosage of 100 mg/L in medium.

Eucalyptus; Eg5; antibiotic; Agrobacterium tumefaciens; sensitivity

S792.39；Q943.2

A

1673-923X(2012)03-0075-06

2011-12-19

863高新技術項目(2011AA100202)

郭利軍(1983—)，男，河北蠡縣人，碩士研究生，主要從事熱帶林木組培快繁和基因轉(zhuǎn)化研究

曾炳山(1969—)，男，江西井岡山人，研究員，博士，從事熱帶林木組培快繁和基因轉(zhuǎn)化研究

[本文編校：吳 毅]