中國南部沿海近岸西加魚毒素研究

徐軼肖,王愛輝,胡 蓉,江天久,江 濤 (1.南京大學(xué)地理與海洋學(xué)院,江蘇 南京 10093；.暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心,廣東 廣州 51063)

中國南部沿海近岸西加魚毒素研究

徐軼肖1,2,王愛輝2,胡 蓉2,江天久2*,江 濤2(1.南京大學(xué)地理與海洋學(xué)院,江蘇 南京 210093；2.暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心,廣東 廣州 510632)

為了查清我國南部沿海珊瑚礁魚類體內(nèi)的西加魚毒素狀況,首次在海南三亞、瓊海、廣西潿洲島、珠海擔(dān)桿列島、廣東徐聞縣燈樓角和福建東山島收集漁民從附近珊瑚礁海域捕撈的野生魚類,采用酶聯(lián)免疫法、小白鼠生物法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行毒素測定.結(jié)果表明,6個調(diào)查海區(qū)均檢測出染毒魚類,總陽性檢出率達(dá)50%,其中福建東山島(77.8%) ＞廣東徐聞縣燈樓角(66.7%) ＞廣東珠海擔(dān)桿列島(55.6%) ＞廣西潿洲島(37.5%) ＞海南三亞(37.5%) ＞海南瓊海(16.7%),與海域環(huán)境質(zhì)量可能存在一定的關(guān)聯(lián).魚組織毒素含量為 0～169ng P-CTX-1/kg肉,8個樣品 (占總樣 17.4%) 超過 100ng P-CTX-1/kg肉,達(dá)到可致人中毒水平.染毒魚種類繁多,主要包括蝴蝶魚科(Chaetodontidae)、鸚嘴魚科(Scaridae)、鳂科(Holocentridae)、笛鯛科(Lutjanidae)和鮨科(Serranidae).酶聯(lián)免疫法與小鼠生物法對魚毒定性檢測結(jié)果基本一致,但僅在福建東山島2個魚樣中檢測到P-CTX-1成分.染毒魚類的毒素含量和魚體重/體長沒有相關(guān)性,也與其食性無關(guān).

西加魚毒素；珊瑚礁魚類；酶聯(lián)免疫法；小白鼠生物法；高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

西加魚毒素(CFP)是指存在熱帶、亞熱帶珊瑚礁地區(qū)一些魚類體內(nèi)的毒素,由甲藻中的岡比藻(Gambierdiscus spp)產(chǎn)生,通過食物鏈的傳遞,經(jīng)草食魚類、肉食魚類而最終影響人類的生命健康.現(xiàn)已證實該毒素主要流行于加勒比海地區(qū)及位于 35'N～35'S之間的印度洋和太平洋地區(qū)[1].我國南部沿海地區(qū)屬熱帶和亞熱帶海域,位于全球西加魚毒主要流行區(qū)域的邊緣地帶,中毒事件時有發(fā)生[2-3].究其原因,一方面是因為該地區(qū)如香港、廣東等地每年與南太平洋島國之間頻繁的活珊瑚魚貿(mào)易[4-5],另一方面則因該地區(qū)鄰近珊瑚礁海域存在毒魚所致[6-7].

盡管早在20世紀(jì)70年代有學(xué)者在西沙群島首次記錄到產(chǎn)西加魚毒素的原因種Gambierdiscu toxicus Rukuro & Yasuwo[8],并在1998年香港赤潮爆發(fā)事件中首次檢測到香港水域亦含Gambierdiscus toxicus[9],但國內(nèi)對該毒素報道仍以綜述介紹為主[10-12],至今未見詳盡的海域調(diào)查.本研究采用酶聯(lián)免疫法、小白鼠生物法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法,調(diào)查我國南部沿海珊瑚礁魚類體內(nèi)的西加魚毒素狀況,旨在弄清該毒素在我國的實際分布情況,為珊瑚礁魚類管理提供依據(jù).

1 調(diào)查區(qū)域與方法

1.1 調(diào)查站位

2007年9月至11月,在海南三亞、瓊海、廣西潿洲島、珠海擔(dān)桿列島、廣東徐聞縣燈樓角和福建東山島(圖1)收集漁民從附近珊瑚礁海域捕撈的野生魚類.每個站位采集6～9種魚類,盡量挑選個體較大的樣品,每種 1～2條.共采集刺豚科(Diodontidae)、鳂科(Holocentridae)、刺尾魚科(Acanthuridae)、鸚嘴魚科(Scaridae)和鮨科(Serranidae)等15個科46份樣品.樣品采集后,置于食品保鮮袋內(nèi)并做好標(biāo)記,冷凍保存運輸至實驗室,-20℃儲存.

圖1 西加魚毒素調(diào)查站位Fig.1 Sampling sites on Ciguatera toxins

1.2 毒素測定方法

用于試劑盒酶聯(lián)免疫檢測Cigua-Check?試劑盒購自美國Oceanit Test Systems公司,操作參考產(chǎn)品說明書,先分別進(jìn)行陽性對照和陰性對照的判斷以保證該試劑盒的敏感性和有效性,然后對樣品進(jìn)行檢測.

對試劑盒檢測結(jié)果呈陽性的樣品進(jìn)一步用小白鼠生物法進(jìn)行檢測.步驟如下:

毒素的提取:稱取 100g已勻漿的魚肉樣品,平均置于 4個潔凈的 250mL離心管中.加注25mL氯仿、50mL甲醇,混勻 1min;再加 25mL氯仿,混勻 15s;加 25mL去離子水,混勻 15s, 2000r/min離心10min,棄去上層的甲醇/水和中層的白色固體,吸取并吹干下層的氯仿提取液.吹干物用10mL甲醇:乙腈(V:V=7:3)溶解后,加20mL正己烷,混勻,然后同上條件離心,去掉上層正己烷,液氮吹干剩下的甲醇/乙腈,殘余物用 1%吐溫60/0.9%生理鹽水稀釋(V: V =1:1)定容備用.

小鼠毒性實驗:每個魚樣提取3份,每份100g.對少數(shù)幾個魚樣肉組織＜300g的樣品,每份提取50g.實驗用小白鼠昆明品系,證號 scxk(粵)2006-0015,購自廣州市第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,體重控制在 19～21g.實驗時,將提取原液 0.5mL或1mL加熱至37℃后注射入小鼠的腹腔內(nèi),每個樣品重復(fù)注射3只小白鼠.記錄每只小鼠的重量、注射時間、注射量、中毒癥狀和死亡時間,同時測定體溫變化.實驗觀察24 h,并用注射相應(yīng)體積1%吐溫 60/0.9%生理鹽水(V:V=1:1)溶液的小鼠為對照組.如果小鼠在40 min內(nèi)死亡,需對提取原液進(jìn)行稀釋并重新注射觀察.實驗時,根據(jù)小鼠腹腔注射后是否出現(xiàn)典型的西加魚毒素中毒癥狀[13]判斷樣品是否染毒.

毒力的計算和表示:樣品的毒性大小用鼠單位(MU)表示.1MU表示使一只重20g的小白鼠在24h死亡所需的腹腔注射劑量.毒力的定量采用劑量-死亡時間關(guān)系方程式 logMU=3.7log (1+T-1)[14]計算,其中MU為小鼠單位,T為存活時間(用h表示).若小鼠4d內(nèi)未死亡但有體溫降低、體重減輕、腹瀉、活動減少等癥狀,則樣品所含毒素劑量為 0.5MU.最后根據(jù)加標(biāo)回收率估算魚肉中毒素的含量[15].

對小白鼠生物法檢測的有毒魚樣以高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對毒素進(jìn)行定量分析.

毒素的提取:提取方法同上,只是經(jīng)液氮吹干后的殘余物用 5mL乙腈:乙酸銨(V:V=1:1)溶解,9500r/min離心 20min,吸取上清液用于上機(jī)檢測.

系統(tǒng)分析條件:HPLC-MS/MS系統(tǒng)分析條件為:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mm i.d × 50mm,1.7um),柱溫40℃.流動相分2路,分別是5mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)和乙腈.梯度洗脫流速 0.2mL/min.采取電噴霧正離子模式,毛細(xì)電壓 3.5kV,錐電壓 30V,源溫度 105℃,提取電壓4.0V,噴霧溫度 350℃,錐氣流速 49mL/min,噴霧氣流速 750L/h.進(jìn)樣量 10μL.選擇西加魚毒素P-CTX-1分子離子[M+NH4]+為前體離子進(jìn)行多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM),質(zhì)荷比(m/z)1076和 1058的碎片離子為P-CTX-1的定性和定量離子.

2 結(jié)果

樣品檢測結(jié)果如表1所示.試劑盒初步檢測發(fā)現(xiàn) 6個采樣區(qū)均含有魚毒,總陽性檢出率達(dá)50%.具體到各采樣區(qū),陽性檢出率從高到低依次為福建東山島(77.8%)、廣東徐聞縣燈樓角(66.7%)、廣東珠海擔(dān)桿列島(55.6%)、廣西潿洲島(37.5%)、海南三亞(37.5%)、海南瓊海(16.7%).本調(diào)查中陽性魚種類繁多,主要包括蝴蝶魚科、鸚嘴魚科、鳂科、笛鯛科和鮨科.

表1 中國南部沿海近岸魚類的西加魚毒素檢測結(jié)果Table 1 Ciguatera toxins in coral fish along the southern coast of China

續(xù)表

續(xù)表

小白鼠法中,除樣品 GDZH7之外,其他使試劑盒呈陽性的魚樣提取液均使小鼠出現(xiàn)典型中毒癥狀,如體溫降低、豎毛、身體蜷縮顫抖、不時用前爪抓嘴、用嘴鉗腹部、呼吸急促,有些還出現(xiàn)步態(tài)僵直、尾巴變黑變硬拱起,其中GDXW1還使小鼠出現(xiàn)后肢麻痹癱瘓.但所有實驗小鼠未發(fā)現(xiàn)腹瀉癥狀.由小鼠法結(jié)果可推知Cigua-Check試劑盒正確檢出率高達(dá)95.7%.

腹腔注射小鼠時,HNQH1、GDXW3、GDXW6、FJDS1和FJDS3這5個魚樣提取液使2只或 3只小鼠致死,魚肉中含毒水平分別為 155, 153,162,164,169ng P-CTX-1/kg肉.FJDS5與FJDS8含毒量均為148ng P-CTX-1/kg肉.其余15個樣品盡管未使小鼠 24h內(nèi)死亡, 但因出現(xiàn)西加魚毒素的典型中毒癥狀而估算成 0.5MU, 即 70ng P-CTX-1/kg肉. P-CTX-1在肉食性魚類組織中含量達(dá)100ng/kg肉時就會對人體構(gòu)成危害[16],因此8個樣品(占總樣 17.4%)達(dá)到可致人中毒水平.總的來說福建東山島樣品的染毒程度比其他海區(qū)高.

挑選小鼠法檢測為陽性的22份樣品進(jìn)一步用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行毒素成分分析,僅在FJDS1和FJDS3中檢測到微量 P-CTX-1,分別為 70, 130ng/kg肉.其他魚樣均未能檢測出 P-CTX-1.因此FJDS3一旦被人食用,可能發(fā)生中毒事件.

3 討論

3.1 3種檢測方法的比較

除GDZH7魚樣試劑盒法與小鼠法定性檢測結(jié)果相異外,其余樣品均相符.分析GDZH未使小鼠出現(xiàn)中毒癥狀的原因可能為魚肉組織內(nèi)毒素含量過低,不足以使小鼠產(chǎn)生反應(yīng),今后有必要對此類樣品進(jìn)行濃縮后再進(jìn)行小鼠法檢測,此外,可能魚肉組織內(nèi)含有的非西加魚毒素聚醚環(huán)化合物與試劑盒免疫抗體發(fā)生交叉反應(yīng),使檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陽性,假陰性和假陽性是試劑盒法無可避免的問題.至于LC-MS/MS法僅檢測出2個樣品含有毒素,這可能是魚體內(nèi) P-CTX-1含量較低,而依據(jù)本方法提取的魚組織不足,導(dǎo)致檢測樣品毒素富集量低于液質(zhì)聯(lián)用的檢測限,另外,魚肉毒素組成除P-CTX-1外,尚含其他西加魚毒素組分,據(jù)研究,僅太平洋法屬波利尼西亞的有毒藻 G. toxicus 和珊瑚礁魚體內(nèi)就存在多達(dá) 23種西加魚毒素[17].目前尚無中國海域西加魚毒素組成的具體信息,可能存在多種非P-CTX-1的西加魚毒素成分,由于缺乏毒素標(biāo)準(zhǔn)品,我國沿海西加魚毒素的成分特征尚需進(jìn)一步研究.

3.2 我國南部沿海西加魚毒素的地理分布

本調(diào)查結(jié)果表明,我國南部福建、廣東沿海的西加魚毒素檢出率高于廣西、海南,這可能與我國南部沿海近岸水質(zhì)環(huán)境差異有關(guān).珊瑚礁的生長狀況與水體環(huán)境質(zhì)量密切相關(guān).在水質(zhì)環(huán)境差的區(qū)域,珊瑚礁“白化”現(xiàn)象嚴(yán)重,而死珊瑚上纖維狀或含鈣基質(zhì)通常是產(chǎn)西加魚毒藻Gambierdiscus spp.生長的依附物.2007年海洋環(huán)境質(zhì)量公報[18-21]數(shù)據(jù)表明,瓊海、三亞近岸監(jiān)測海域均為清潔海域,潿洲島水質(zhì)屬清潔、較清潔類,而珠海市近岸海水水質(zhì)中度及以上污染,東山島附近亦有約 40%水體中度及以上污染,由此可推知,較劣水質(zhì)諸如東山、珠海近岸的珊瑚礁更易遭受破壞,而利于產(chǎn)毒藻密度的增加,從而使該海域直接或間接攝食該藻的珊瑚魚染毒程度較高.徐聞近岸海域水體屬清潔、較清潔類,但其樣品陽性檢出率仍達(dá) 66.7%,推測染毒魚類由附近高污染海域洄游至此.然而,自 1974年在西沙群島首次記錄到 Gambierdiscu toxicus[8]以來,我國沿海尚未進(jìn)行詳細(xì)的Gambierdiscus spp.地域調(diào)查,亦缺乏該藻的純培養(yǎng)株,因此,我國南部沿海西加魚毒素地理分布差異的原因有待進(jìn)一步考證.另外,也不排除本研究采集的這些魚類樣品為非本海域種,而由其他海域洄游至此.呂頌輝等[11]指出,我國近海染有西加魚毒的魚類與產(chǎn)毒藻存在密切聯(lián)系,但不排除部分有毒魚由境外海域洄游到我國的可能性.

本調(diào)查總?cè)径爵~檢出率(50%)遠(yuǎn)高于鄰近的日本沖繩島(17.6%)[22],可能是因為水域環(huán)境差異,我國南部沿海水質(zhì)較差,更適合Gambierdiscus spp.生長,易使珊瑚魚染毒,此外,本研究區(qū)域更靠近赤道,終年水溫較高,更適合產(chǎn)毒藻及珊瑚魚生存.

3.3 染毒魚類的特點

Oshiro等[22]的研究表明,沖繩島海域染毒魚體內(nèi)的毒素含量和魚體重、體長成正相關(guān),即體重/體長越大,毒素含量越高,本調(diào)查結(jié)果未呈現(xiàn)上述特征,而與Pottier等[23]、Chinain等[24]的結(jié)果一致,即魚組織內(nèi)毒素的含量和魚體重/體長沒有相關(guān)性.值得注意的是,以小鼠法檢測出的 22個有毒樣品中肉食性魚類和其他食性魚類各占50%,通過HPLC-MS/MS 檢出含P-CTX-1的2個魚樣FJDS1 和FJDS3, 前者為肉食性,后者屬雜食性魚類,這些均意味著我國海域染毒魚在食性上并無明顯差異,個體小的魚類因生境及攝食習(xí)慣仍可含有較高的毒素,因此,避食大個體珊瑚魚或肉食性珊瑚魚并不能使消費者避免西加魚毒中毒,使我國對該類毒素的管理面臨嚴(yán)峻問題.

4 結(jié)論

4.1 6個調(diào)查站位均含有毒魚,總陽性檢出率達(dá) 50%,其中福建東山島(77.8%) ＞廣東徐聞縣燈樓角(66.7%) ＞廣東珠海擔(dān)桿列島(55.6%) ＞廣西潿洲島(37.5%) ＞海南三亞(37.5%) ＞海南瓊海(16.7%),其與海域環(huán)境質(zhì)量可能存在一定的關(guān)聯(lián).

4.2 染毒魚種類繁多,主要包括蝴蝶魚科、鸚嘴魚科、鳂科、笛鯛科和鮨科.

4.3 免疫試劑盒法與小白鼠生物法對毒素定性檢測結(jié)果基本一致,僅在福建東山島2份魚樣中檢測到P-CTX-1.

[1] Roeder Karin, Erler Katrin, Kibler Steven, et al. Characteristic profiles of Ciguatera toxins in different strains of Gambierdiscus spp.[J]. Toxicon, 2010,56:731-738.

[2] 廖清高,隋敏生,陳紀(jì)平.雪卡毒素中毒的臨床特征 [J]. 罕少疾病雜志, 2001,8(2):14-15.

[3] 胡亞民,陳偉強(qiáng),關(guān)權(quán)煊,等.雪卡毒素中毒 132例臨床分析 [J].中華內(nèi)科雜志, 2005,44(10):778-779.

[4] Wong Chun-Kwan, Hung Patricia, Lee Kellie L H, et al. Study of an outbreak of ciguatera fish poisoning in Hong Kong [J]. Toxicon, 2005,46:563-571.

[5] Wong Chun-Kwan, Hung Patricia, Lee Kellie L H, et al. Features of Ciguatera Fish Poisoning Cases in Hong Kong 2004-2007 [J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2008,21(6):521-527.

[6] 伍漢霖,莊棣華,陳永豪,等.中國珊瑚礁毒魚類的研究 [J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報, 2002,9(4):298-307.

[7] Tsai Wei-Lung, Chen Hong-Ming, Hsieh Cheng-hong, et al. A potential methodology for differentiation of ciguatoxin -carrying species of moray eel [J]. Food Control, 2009,20(6):575-579.

[8] 陳國蔚.西沙群島甲藻的研究Ⅲ. 幾種罕見的熱帶大洋性甲藻[J]. 海洋與湖沼, 1989,20(3):230-237.

[9] Lu Songhui, Hodgkiss I J. Harmful algal bloom causative collected from Hong Kong waters [J]. Hydrobiologia, 2004,512: 231-238.

[10] 華澤愛.西加魚毒的毒素研究概況 [J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 1994, 13(1):57-63.

[11] 呂頌輝,李 英.我國西加魚毒流行現(xiàn)狀研究進(jìn)展 [J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006,22(2):226-227.

[12] 李春媛,周 玉,張 磊,等.西加毒素的研究概況 [J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2009,18(3):365-371.

[13] Lehane Leigh, Lewis Richard J. Ciguatera: recent advances but the risk remains [J]. International Journal of Food Microbiology, 2000,61(2-3):91-125.

[14] 王愛輝.西加魚毒素檢測及其在我國南海近岸的分布 [D]. 廣州:華南師范大學(xué), 2008,17-30.

[15] Lewis Richard J. Detection of ciguatoxins and related benthic dinoflagellate toxins: in vivo and in vitro methods [J]. IOC Manuals Guides (UNESCO), 1995, 3:135-161.

[16] Lewis Richard J, Jones Alun, Vernoux Jean-Paul, et al. HPLC/tandem electrospray mass spectroscopy for the determination of subppb levels of Pacific and Caribbean ciguatoxins in crude extracts of fish [J]. Anal. Chem, 1999, 71: 247-250.

[17] Yasumoto Takeshi. The chemistry and biological function of natural marine toxins [J]. The Chemical Record, 2001,1(3):228-242.

[18] 海南省海洋與漁業(yè)廳.2007年海南省海洋環(huán)境公報 [EB/OL]. http://www.hainan.gov.cn/data/news/2008/06/52990/. 2008.

[19] 廣西壯族自治區(qū)海洋局.廣西壯族自治區(qū)2007年海洋環(huán)境質(zhì)量[EB/OL]. http://www.gxoa.gov.cn/NewsView.aspx? id = 525. 2008.

[20] 廣東省海洋與漁業(yè)局.2007年廣東省海洋環(huán)境質(zhì)量公報[EB/OL].http://www.gdofa.gov.cn/News/2009/10/21/2009102185 821B3R4M. htm. 2008.

[21] 福建省海洋與漁業(yè)局. 2007年福建省海洋環(huán)境狀況公報[EB/OL].http://www.fjof.gov.cn/_xxgk/sjgg/hjzltb/index.html?id =1021.2008.

[22] Oshiro Naomasa, Yogi Kentaro, Asato Shuko, et al. Ciguatera incidence and fish toxicity in Okinawa, Japan [J]. Toxicon, 2010, 56:656-661.

[23] Pottier Ivannah, Vernoux Jean-Paul, Jones Alun, et al. Characterisation of multiple Caribbean ciguatoxins and congeners in individual specimens of horse-eye jack (Caranx latus) by high-performance liquid chromatography/mass spectrometry [J]. Toxicon, 2002,40:929-939.

[24] Chinain Mireille, Darius H Taiana, Ung André, et al. Ciguatera risk management in French Polynesia: The case study of Raivavae Island (Australes Archipelago) [J]. Toxicon, 2010,56: 674-690.

Ciguatera toxins in coral fishes along the southern coast of China.

XU Yi-xiao1,2, WANG Ai-hui2, HU Rong2, JIANG Tian-jiu2*, JIANG Tao2(1.School of Geographical and Oceanographic Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China；2.Research Center of Harmful Algae Blooms and Aquatic Environment Science, Jinan University, Guangzhou 510632, China). China Environmental Science, 2012,32(2)：330～336

The Ciguatera toxins(CTXs) in coral fish along the southern coast of China were investigated for the first time through collecting wild coral fish samples in Sanya and Qionghai of Hainan, Weizhou Island of Guangxi, Zhuhai and Xuwen Dengloujiao of Guangdong and Dongshan Island of Fujian. By using three different analysis methods including Cigua-Check? Kit, Mouse Bioassay and HPLC-MS/MS, toxic fishes existed in all six sampling areas, and the total detection rate was 50%. Respectively, the detection rate for Dongshan Island of Fujian (77.8%) ＞ Xuwen Dengloujiao of Guangdong (66.7%) ＞ Zhuhai Danganliedao of Guangdong (55.6%) ＞ Weizhou Island of Guangxi (37.5%) ＞ Sanya of Hainan (37.5%) ＞ Qionghai of Hainan(16.7%). Toxin content of fish varied in 0～169 ng P-CTX-1/kg flesh and generally showed relation to the water quality. There were eight samples, the ratio of 17.4% for total samples, exceeded 100 ng P-CTX-1/kg flesh that could poison human beings, and toxic species principally involved were Chaetodontidae, Scaridae, Holocentridae, Lutjanidae and Serranidae. Except on one sample from Zhuhai Danganliedao, Cigua-Check? kit has the same result with Mouse Bioassay on toxin qualitative analysis, while the component of CTXs, P-CTX-1 was only found in two samples of Dongshan Island, Fujian by HPLC-MS/MS. Finally, there was no significant correlation between fish toxicity and the parameters of its weight, length and feeding habits.

ciguatera toxins；coral fish；ELISA；mouse bioassay；HPLC-MS/MS

2011-05-05

國家自然科學(xué)基金資助項目(U0733006);國家“973”項目(2010CB428702);國家“908”赤潮災(zāi)害調(diào)查專項(SZ801);廣東908赤潮災(zāi)害評價專項(GD908-02-14)

*責(zé)任作者,教授, tjiangtj@jnu.edu.cn

X503.225

A

1000-6923(2012)02-0330-07

徐軼肖(1977-),女,浙江蘭溪人,南京大學(xué)博士研究生,主要從事海洋生態(tài)與生物毒素研究.發(fā)表論文10篇.