苜蓿褐斑病菌離體葉片接種方法及侵染途徑觀察

王華榮，史 娟，2，任 斌

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021；2.西部土地退化與生態(tài)恢復(fù)國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川750021）

苜蓿褐斑病是由苜蓿假盤菌（Pseudopeziza medicaginis）引致的葉部病害，在全世界各苜蓿種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，特別是在氣候冷涼和高海拔地區(qū)，更為嚴(yán)重和普遍［1-2］。在中國，苜蓿褐斑病是嚴(yán)重威脅苜蓿生產(chǎn)的重要病害，主要分布在西北、華北、東北等苜蓿栽培區(qū)，流行年份可使苜蓿減產(chǎn)40%～60%，落葉3%～73%，嚴(yán)重影響苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，成為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿的主要生物限制因子之一［3］。近十年來，隨著苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，苜蓿褐斑病的研究得到了長足發(fā)展，研究內(nèi)容涉及細(xì)胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域［4-8］。草地生態(tài)系統(tǒng)的特殊性，在一定程度上限制了化學(xué)農(nóng)藥的使用，因此，生產(chǎn)中通過種植抗病品種控制其流行危害，是目前苜蓿生產(chǎn)中急需解決的課題之一。

鑒定和評價苜蓿種質(zhì)資源對褐斑病的抗病性，是選育和利用抗病品種的基礎(chǔ)，這些基礎(chǔ)工作離不開病害的人工接種。自然狀態(tài)下，苜蓿假盤菌在葉片上形成成熟的子囊盤隨落葉進入土壤中越冬，翌年當(dāng)雨水較多時，子囊孢子彈射至葉片上完成初侵染，侵染關(guān)系建立后，隨著病菌在葉片組織內(nèi)的擴展，形成直徑約1mm的子囊盤。由于子囊孢子的成熟和釋放直接影響接種效果，有關(guān)苜蓿褐斑病的接種技術(shù)，一直是國內(nèi)外研究者關(guān)注的問題［9-11］，目前雖篩選出了一些接種方法，但接種效果差異較大。為了篩選出適宜的接種方法，完善該病害的實驗研究技術(shù)，本研究選用5種接種方法進行了接種效果的對比，以期篩選出接種量高、污染少的接種技術(shù)，并利用該方法對苜蓿假盤菌子囊孢子的萌發(fā)和侵入情況進行掃描電鏡觀察。

1 材料與方法

1.1 供試菌種、苜蓿品種及其培養(yǎng)、繁殖 苜蓿假盤菌分離自寧夏固原原州區(qū)苜蓿引種試驗區(qū)的阿爾岡金（Medicagosativacv.Algonquin）病葉。挑取20%V8汁CaCO3平板上分離培養(yǎng)的苜蓿假盤菌菌落，加入適量的滅菌水搗碎，制成菌落懸浮液，移入20%V8汁CaCO3培養(yǎng)基上擴繁。

供試苜蓿品種為德國大葉（M.sativacv.Germany），由寧夏大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所提供。按常規(guī)方法種植于直徑為30cm的花盆內(nèi)，正常管理。株高生長至10cm左右時剪取生長一致的苜蓿葉片（保留葉柄），用滅菌水沖洗2遍后，置于底部鋪有保濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)待用。

1.2 接種方法 選用以下5種接種方法，利用離體的苜蓿葉片進行接種試驗。

逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法：將V8培養(yǎng)基上成熟的苜蓿假盤菌菌落挑出，移至底部鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿蓋上，置于20℃、黑暗條件下保濕4～6h，取出置于苜蓿葉片的正上方，利用子囊盤自然彈射進行接種，2～4h后將接種菌落移出。為了保證離體葉片上有足夠的游離水，不定期地用滅菌水對接種后的離體葉片進行噴霧。

菌落懸浮液涂抹法：選取生長30d左右成熟的菌落，置于滅菌小燒杯中，加入滅菌水2mL，用滅菌的鑷子充分將菌落搗碎，制成菌落懸浮液，用潔凈毛筆刷將懸浮液涂抹在苜蓿葉片上。

菌落接種法：將成熟的菌落置于每個葉片中間，噴滅菌水保濕、蓋上培養(yǎng)皿蓋。

病葉接種法：將田間采集的苜蓿褐斑病病葉用滅菌水反復(fù)沖洗后，置于燒杯中，加入適量的滅菌水4℃下浸泡48h左右，取出置于濕潤的濾紙上，將濾紙放入培養(yǎng)皿蓋或瓷盤上，倒置在苜蓿葉片上方。

孢子懸浮液噴霧法：將配制好的菌落懸浮液轉(zhuǎn)入常規(guī)離心機離心后取上清液即為孢子懸浮液，懸浮液濃度為（3.0×105）～（1.5×106）mL-1，將孢子懸浮液移入小型噴霧器內(nèi)對苜蓿葉片進行噴霧接種。

將接種后的苜蓿葉片均置于20℃黑暗條件下培養(yǎng)。

1.3 接種結(jié)果觀察 于接種后8h取樣，將接種的苜蓿葉片透明后置于光鏡下觀察孢子數(shù)量及其萌發(fā)狀況。樣品的脫色和透明處理：首先用脫色液脫色14h（脫色液的體積比為三氯乙酸∶乙醇∶氯仿＝0.3∶150∶50），其次用飽和的水合三氯乙醛［CCl3CH（OH）2］（2.5g·mL-1）進行透明［12］24h。40%甘油制片，Olympus微分干涉相差顯微鏡觀察和拍照。

1.4 掃描電鏡（SEM）樣品的制備與觀察 分別于接種后6、12、24h取樣，并將葉片切成1cm2的小塊，按康振生［13］的方法處理樣品。先將樣品在4%的戊二醛磷酸緩沖液（0.1mol·L-1、pH值6.8）中于4℃下固定8～12h。然后用相同的緩沖液沖洗2h、系列乙醇脫水，醋酸異戊脂置換，二氧化碳臨界點干燥、粘樣、噴金后，在JEOL-JSM-6360LV型掃描電鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種效果比較 比較5種接種方法，接種到苜蓿葉片上的孢子數(shù)量明顯不同（圖1），其中以逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法接種孢子數(shù)量最多，平均每個葉片60多個；其次是病葉接種法，平均達28個；菌落接種法，平均為21個；孢子懸浮液噴霧法接種，平均為12個；菌落懸浮液涂抹法接種最少，平均為6個。接種質(zhì)量也明顯不同，逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法接種到葉片上的孢子整齊、干凈，葉片表面沒有雜質(zhì)（圖2），而菌落葉片接種法雖釋放出一定量的孢子，但葉片和菌落接觸的部位易造成損傷，影響結(jié)果觀察；病葉接種優(yōu)于菌落和孢子懸浮液接種法，但病葉上附生的雜菌同時也接種到葉片上，干擾了結(jié)果的觀察；效果最差的為孢子和菌落懸浮液接種法，不僅接種孢子數(shù)量少，且葉片表面有很多的雜質(zhì)及未破碎的子囊和子囊盤。用逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法無論是接種在水瓊脂表面還是苜蓿葉面的孢子，不僅數(shù)量較多，整齊一致，且葉面干凈，有利于接種結(jié)果的觀察（圖3）。通過比較分析認(rèn)為，逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法優(yōu)于其他4種接種方法，是該病害較為理想的接種方法。

圖1 5種接種方法的孢子數(shù)Fig.1 Number of spores by different inoculation methods

圖2 逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法接種在水瓊脂表面的子囊孢子Fig.2 Ascospore on the surface of water agar surface naturally ejected by reverse spore-generating method

圖3 逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法接種到苜蓿葉片表面的子囊孢子（標(biāo)遲為10μm）Fig.3 Ascospore on the surface of alfalfa leaf naturally ejected by reverse spore-generating method（Yardstick：10μm）

2.2 苜蓿褐斑病菌侵入途徑的SEM觀察光鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種到苜蓿葉片上的子囊孢子為卵圓形，2～4h開始萌發(fā)（圖3-1，圖4-1），平板統(tǒng)計4h萌發(fā)率超過90%。從孢子的中部萌發(fā)產(chǎn)生單根芽管，兩端不萌發(fā)，12～24h萌發(fā)的芽管直接侵入苜蓿葉片組織（圖3-2，圖4-2）。半薄切片清晰地顯示出芽管以機械方式穿透寄主表皮組織，直接進入表皮細(xì)胞，穿透部位的細(xì)胞壁未觀察到縊縮現(xiàn)象（圖4-4），且侵入到表皮細(xì)胞中的菌絲未觀察到膨大現(xiàn)象。同時還觀察到葉片上的部分孢子從葉片的細(xì)胞胞間隙處侵入（圖4-3），24h以后，成功侵入的孢子整體開始出現(xiàn)坍陷（圖4-2）。從孢子萌發(fā)到侵入苜蓿葉片組織未觀察到附著胞等侵染結(jié)構(gòu)的形成，但少數(shù)孢子芽管頂端略有膨大（圖3-2，圖4-3），12至24h內(nèi)孢子基本完成接觸、萌發(fā)到侵入的全過程。在觀察過程中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)孢子在葉片上以芽管直接侵入，僅有少數(shù)孢子通過細(xì)胞胞間隙侵入，但始終未觀察到孢子由氣孔侵入。這表明接種至葉片上的P.medicaginis侵入部位沒有選擇性，除氣孔之外，葉片上的任何部位都可以侵入，機械穿透是苜蓿褐斑病菌最主要的侵入方式。

圖4 苜蓿假盤菌子囊孢子在寄主葉表萌發(fā)和侵入的掃描電鏡圖Fig.4 Ascospore on the surface of host leave naturally ejected by reverse spore-generating method

3 討論

本研究采用5種接種方法，通過接種量和葉面有無雜菌污染等進行對比，篩選出適宜于苜蓿假盤菌的接種方法為逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法。該方法操作簡單、快速，接近自然狀態(tài)下的孢子釋放，且接種孢子數(shù)量多、均勻，葉片沒有雜菌和雜質(zhì)污染，可清晰地觀察到試驗結(jié)果，是一種理想的室內(nèi)實驗接種技術(shù)。孢子懸浮液噴霧接種法是葉部病害常用的接種方法，對于苜蓿假盤菌來說噴霧法則不太理想，原因可能是子囊孢子不同于分生孢子，需從子囊中釋放出來才能進行有效的接種。國內(nèi)學(xué)者報道利用不同緩沖液配制的孢子懸浮液是比較理想的接種方法［9］，這可能是緩沖液中的葡萄糖有利于孢子釋放，而使得配制的孢子懸浮液中游離的孢子數(shù)量增多。利用田間發(fā)病的病葉進行接種，取決于子實體的發(fā)育程度。除此之外，病葉浸泡程度達不到子囊盤的充分吸漲，孢子也不能釋放。國外研究者［10-11］利用田間感病的病株或病葉作為接種源，懸掛于接種苜蓿的上方進行接種。但是該方法接種至葉片上的雜菌比較多，影響接種效果。本研究通過掃描電鏡觀察，利用逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法接種苜蓿葉片，首次證實了P.medicaginis以機械穿透的方式侵入寄主組織，侵入途徑?jīng)]有選擇性，可以是葉片上的任何一個部位，少數(shù)孢子也可以從細(xì)胞胞間隙處侵入，但始終未觀察到孢子由氣孔侵入以及孢子侵入前形成附著胞等侵染結(jié)構(gòu)。苜蓿假盤菌子囊孢子不形成侵染結(jié)構(gòu)，以芽管直接侵入，這一現(xiàn)象說明，芽管除了機械穿透外，可能涉及化學(xué)侵入的酶解作用。前人［14］有研究表明，沒有明顯侵染結(jié)構(gòu)分化的真菌，致病主要靠酶解而不是機械穿透力。關(guān)于苜蓿假盤菌依靠何種力量侵入寄主，尚有待于進一步系統(tǒng)研究。這些研究結(jié)果的獲得，將會為進一步闡明苜蓿假盤菌侵入機制提供線索。彈射到葉片表面的成對的孢子被一層膜包裹，這與 Morgan和Parbery［14］觀察到的結(jié)果一致。猜測膜的作用可能是將孢子黏附在葉片表面，起到固定的作用，也可能是粘膜能夠保持一定的水分，以滿足釋放到體外孢子的萌發(fā)，從而更有利于在短時間內(nèi)侵入寄主。Morgan和Parbery［14］通過超顯微研究還發(fā)現(xiàn)，成對的孢子被包圍在一個普通的膜囊內(nèi)，成對孢子外圍臘狀晶體結(jié)構(gòu)有飾紋，每一部分的邊緣有輕微的隆起，并得出成對的孢子有助于孢子附著在寄主表面。

4 結(jié)論

適宜于苜蓿褐斑病的室內(nèi)接種方法為逆向產(chǎn)孢培養(yǎng)法，該方法為病害的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究提供了接種技術(shù)。P.medicaginis子囊孢子侵入前不形成附著胞等侵染結(jié)構(gòu)，主要的侵入途徑可以是葉片上除氣孔之外的任何部位，以機械穿透直接侵入寄主細(xì)胞。

致謝：本論文中的掃描電鏡研究在西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室完成，在此謹(jǐn)表謝意。

［1］南志標(biāo).我國的苜蓿病害及其綜合防治體系［J］.動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2001，18（4）：1-4.

［2］袁慶華，李向林，張文淑.苜蓿假盤菌及其生物學(xué)特性研究［J］.植物保護，2001，27（1）：8-12.

［3］張蓉，馬建華，楊芳，等.寧夏苜蓿主要病害田間發(fā)生規(guī)律的研究［J］.石河子大學(xué)學(xué)報，2004，22：168-171.

［4］史娟，韓青梅，張宏昌，等.苜蓿假盤菌侵染苜蓿葉片的細(xì)胞學(xué)研究［J］.菌物學(xué)報，2008，27（2）：183-192.

［5］王瑜，袁慶華，李向林，等.與苜蓿褐斑病（CLS）抗性基因連鎖的SRAP標(biāo)記研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（2）：438-442.

［6］袁慶華，張君艷.苜蓿假盤菌ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化及指紋圖譜構(gòu)建［J］.草地學(xué)報，2008，16（1）：117-22.

［7］畢波，王瑜，袁慶華.苜蓿褐斑病抗性相關(guān)分子標(biāo)記驗證［J］.草地學(xué)報，2011，19（4）：663-667.

［8］孟芳，袁慶華，蘇德榮.苜蓿抗褐斑病基因ISSR標(biāo)記的篩選及驗證［J］.植物保護，2008，34（4）：46-49.

［9］宋衛(wèi)玲，袁慶華.苜蓿褐斑病接種方法研究［J］.中國草地學(xué)報，2006，28（5）：38-41.

［10］Pratt R C.Screening for resistance toSclerotiniatrifuliorumin alfalfa by inoculation of excised leaf tissue［J］.Phytopcothology，1996，86：923-928.

［11］Cohen R.A leaf assay for detection of resistance of melons toSphaerothecafuliginearece ［J］.Plant Disease，1993，77：513-517.

［12］張敬澤，徐同.柿樹炭疽菌侵染不同柿樹種、品種和部位的 細(xì) 胞 學(xué) 研 究 ［J］.菌 物 系 統(tǒng)，2005，24（1）：116-112.

［13］康振生.植物病原菌超微結(jié)構(gòu)［M］.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

［14］Morgan W C，Parbery D G.Ascospore liberation，ger-mination and attachment to host surface byPseudopezizamedicaginis［J］.Australian Journal of Agricultural Research，1977，28（5）：777-784.