復方梔子油軟膠囊的長期毒性實驗研究

陳雅慧 朱 梅 李寶莉 朱建文 張正祥 成延萍

1.延安大學醫(yī)學院生理教研室，陜西延安 716000；2.廣西山云生化科技有限公司，廣西柳州 545600

酸棗仁油、梔子油配伍柏子油制成復方梔子油軟膠囊，有學者已對其最佳組方、主要藥效學、制劑工藝學進行了研究，該復方具有安神、益智、耐缺氧、改善體能等作用[1-3]，并由藥食同源原料組成，既安全又符合中藥組方理論。本研究為了對復方油梔子油軟膠囊的安全性評價作進一步的研究，觀察長期服用該膠囊的毒性作用，通過大鼠連續(xù)灌胃給藥90、120 d，并于停藥14 d后，觀察大鼠外觀、血常規(guī)、肝腎功能等改變和臟器組織的毒性變化，以便為臨床用藥提供參考，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠[SCXK（軍）2002-005]，二級合格動物。

1.2 實驗藥品及試劑

1.2.1 藥品 酸棗仁油購自陜西旭煌植物科技發(fā)展有限公司（批號：XHS-080107）；柏子油由廣西山云生化科技有限公司提供（批號：081012）；梔子油由廣西山云生化科技有限公司生產(chǎn)（批號：080501）。酸柏梔油軟膠囊是將酸棗仁油、柏子仁油、梔子油按3∶3∶1比例配伍，由西安東盛醫(yī)藥研究所制備成0.5 g/粒（批號：081120）。血液生化所需試劑均選用中生北控生物科技股份有限公司。

1.2.2 試劑 脂肪酸甲酯標準品、正己烷、甲醇、石油醚（60～90℃）、無水甲醇、無水乙醚、無水硫酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.3 方法

取SD大鼠120只，體質(zhì)量60～90 g/只，每組30只，雌雄各半，依體質(zhì)量隨機均為四組：空白對照組灌胃注射生理鹽水7 mL/kg，大劑量組灌胃復方梔子油20 mL/kg，中劑量組灌胃復方梔子油6 mL/kg，小劑量組灌胃復方梔子油2 mL/kg。每天給藥1次，連續(xù)120 d，每周稱體質(zhì)量1次，并觀察動物活動、毛發(fā)、糞便情況，分別于用藥90、120 d和停藥14 d結(jié)束后，每組各取1/3（10只）動物（雌雄各半，其余動物繼續(xù)飼養(yǎng)觀察），采血檢查血常規(guī)、血生化，致死，取心、肝、脾、肺、腎、胸腺、皮膚、腦、十二指腸、小腸、睪丸（卵巢）、附睪（子宮）、直腸共13個臟器組織做病理學檢查[4]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量的變化

四組大鼠在90、120 d及停藥2周試驗期內(nèi)均活動均正常，毛發(fā)光潤，體質(zhì)量增長正常，未見糞便異常，無一死亡。四組動物體質(zhì)量增長情況，90、120 d后中劑量雄性組動物體重增長較大，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 復方梔子油軟膠囊給藥90、120 d及停藥14 d各組大鼠體質(zhì)量的經(jīng)時變化（±s，g，n=15）

表1 復方梔子油軟膠囊給藥90、120 d及停藥14 d各組大鼠體質(zhì)量的經(jīng)時變化（±s，g，n=15）

注：與正常組比較，*P＜0.05

?

2.2 各組大鼠在不同時期血液學指標

四組動物連續(xù)給藥90、120 d后及停藥2周后血常規(guī)化驗結(jié)果顯示，小劑量組90 d后及停藥2周后中間細胞百分比及粒細胞百分比，120 d后中間細胞百分比及粒細胞百分比；中劑量90 d后及停藥2周后中間細胞百分比；大劑量90 d后中間細胞百分比及粒細胞百分比，120 d后及停藥2周后中間細胞百分比，與正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），其余各組指標無異常。見表2。

表2 各組大鼠在不同時期血液學指標的變化（±s，n=10）

表2 各組大鼠在不同時期血液學指標的變化（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01

組別 時間 紅細胞（×1012 g/L）血紅蛋白（g/L）白細胞（×109 g/L）淋巴細胞百分比（%）中間細胞百分比（%）粒細胞百分比（%）血小板（×109 g/L）凝血酶原時間（s）正常組小劑量組中劑量組大劑量組90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后7.36±0.42 7.37±0.56 7.35±0.33 7.35±0.95 7.37±1.13 7.34±0.86 6.91±0.85 7.70±0.44 6.90±0.82 7.53±0.61 7.73±0.95 7.73±0.62 154.90±14.69 161.00±26.58 148.80±15.69 150.80±21.85 148.80±21.69 146.40±21.50 142.00±18.43 153.20±11.57 143.00±19.42 157.80±12.18 151.20±27.81 154.20±28.82 5.80±1.52 4.72±1.97 4.66±1.95 5.43±1.55 6.04±1.88 6.18±3.77 4.76±1.71 3.63±0.77 4.36±1.70 4.90±0.49 3.94±0.85 3.94±0.94 54.34±2.85 57.42±9.09 52.88±2.84 56.96±5.92 52.84±3.04 54.04±4.16 51.64±6.72 51.24±4.77 50.74±7.72 55.46±2.12 54.74±2.28 53.74±2.23 14.96±2.03 10.98±1.57 11.78±1.03 19.69±3.45**21.86±3.39**20.12±4.40**19.06±4.52**12.98±2.72 19.86±4.62**22.18±2.43**20.88±5.97**20.78±6.97**30.98±5.94 30.47±8.12 35.34±2.43 23.35±4.57**27.66±3.98 23.84±4.06**29.8±6.12 34.34±6.91 29.4±6.90 19.81±2.80**26.45±7.57 25.44±7.55 917.20±107.61 840.09±133.82 906.80±136.26 794.80±132.43 789.80±60.07 804.40±241.04 873.83±177.65 780.67±98.02 864.80±167.75 970.21±146.71 890.90±141.04 899.00±241.04 10.50±1.69 10.54±1.73 11.34±1.74 9.28±1.42 10.14±1.41 9.92±2.41 12.18±1.22 11.76±3.65 11.47±2.64 8.44±0.66 8.60±0.36 9.58±1.39

2.3 各組大鼠不同時期血液生化學指標

四組動物連續(xù)給藥90、120 d后及停藥2周后血生化結(jié)果顯示，小、大劑量組90 d后及中劑量組120 d后，尿糖水平較對照組降低，可能與禁食時間太長有關(guān)；中、大劑量組尿素氮增加；大劑量組90 d后尿蛋白及γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶減少，白蛋白、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶增加；中劑量組120 d后尿蛋白、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶降低，尿素氮、白蛋白、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶增加，停藥2周后，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶降低，堿性磷酸酶增加；小劑量組120 d尿蛋白降低，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶均升高，90、120 d后γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶減少，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同時期血液生化學指標（±s，n=10）

表3 各組大鼠不同時期血液生化學指標（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

（mmol/L）（g/L）（g/L）（U/L）氨酶（U/L）γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（U/L）正常組小劑量組中劑量組大劑量組90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后9.42±1.10 8.75±1.53 10.27±3.29 5.08±1.20**8.02±1.54 13.16±2.25 6.93±1.08 5.94±2.44*9.25±2.59 6.59±3.08*8.17±3.60 11.70±0.78 0.37±0.33 0.09±0.02 8.31±2.38 0.96±0.37 0.92±0.81 4.93±1.04 2.82±1.11**1.08±0.89 9.02±5.01 2.89±1.73**0.58±0.59 5.10±0.38 82.22±3.72 70.62±5.55 145.96±94.99 77.86±3.16 49.04±5.77**73.10±5.66 58.52±17.29**25.06±2.68**102.77±110.09 29.6±0.95**73.26±25.28 77.15±3.32 41.56±1.52 36.06±6.06 35.38±1.68 41.78±1.46 38.26±1.24 31.58±15.57 38.58±2.83 42.66±7.48*37.97±3.25 35.98±3.81*38.92±2.04 38.05±2.05 45.90±9.36 39.60±27.24 52.27±26.31 34.23±6.32 70.36±44.04 43.35±8.07 42.37±21.08 106.43±52.27*27.35±18.27*47.80±10.67 72.51±44.51 87.30±39.30 3.20±2.89 7.06±9.45 138.72±23.86 232.80±38.03**225.82±61.63**56.77±55.72*222.94±90.21**301.60±90.89**204.90±56.85 231.64±69.50**219.86±48.11**125.24±42.78 11.19±10.87 1.12±0.73 28.86±49.41 0.42±.034**0.59±0.30**12.65±3.39 0.46±0.29**1.09±0.84**9.60±0.66 1.69±1.26**0.64±0.46**11.85±0.69堿性磷酸酶（U/L）64.00±25.08 4.73±2.20 141.60±59.29 63.60±25.51 5.89±4.16 103.40±38.10 115.80±45.75*2.88±1.89 888.25±948.21**152.80±26.56**2.97±1.95 101.50±9.19

2.4 各組大鼠不同時期血脂及離子水平指標

結(jié)果顯示，中劑量組90 d總膽固醇增加，總膽紅素降低，膽固醇大劑量減少；120 d K+減少，停藥2周后，Na+增加；大劑量組90 d后總膽紅素及肌酸磷酸激酶減少，120 d后肌酸酐及肌酸磷酸激酶上升，總膽紅素降低，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），表明復方梔子油軟膠囊對肝腎功能的影響并不確定。見表4。

表4 各組大鼠不同時期血脂及離子水平指標（±s，mmol/L，n=10）

表4 各組大鼠不同時期血脂及離子水平指標（±s，mmol/L，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 時間 膽固醇 三酰甘油 肌酸酐 總膽紅素 肌酸磷酸激酶 K+正常組小劑量組中劑量組大劑量組90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后3.01±2.68 123.60±31.35 3.70±3.14 2.17±0.18 141.40±22.81 2.14±0.56 7.13±2.49**111.20±7.46 2.32±0.72 1.10±0.92*1.17±35.13 2.04±0.54 1.21±0.18 0.75±0.30 0.65±0.17 0.60±0.13 0.57±0.18 0.68±0.12 0.62±0.29 0.70±0.10 0.66±0.15 0.21±0.01 0.66±0.13 0.53±0.09 19.52±1.76 22.48±12.10 87.58±19.15 6.06±2.31 21.94±6.11 92.08±41.07 16.40±3.50 11.32±11.44 71.72±11.16 16.86±5.55 25.54±14.68**10.65±2.33 57.08±17.56 6.14±2.58 7.14±2.85 56.72±32.34 13.04±6.50 13.01±5.50 14.80±2.00**10.40±2.57 11.40±4.57 13.46±4.77**23.02±8.94**14.20±7.85 1 014.20±984.37 708.40±170.69 556.60±326.47 538.60±293.55 810.00±229.11 907.60±768.70 522.60±225.89 849.20±320.61 681.25±510.67 88.60±44.25**2 226.80±1 525.06**620.50±152.02 5.26±0.81 3.16±0.29 3.86±0.55 5.46±0.41 3.54±0.36 4.10±0.90 5.16±0.15 4.20±0.10*3.32±0.33 5.28±0.55 3.33±0.56 3.27±0.02 Na+ Cl-123.40±7.76 141.39±0.85 140.04±1.25 128.80±7.46 140.10±0.55 131.06±1.10*137.20±1.64 142.12±2.95 137.20±1.39*138.00±1.73 139.81±1.02 137.30±3.11 90.40±6.65 102.04±1.04 103.56±1.18 94.40±5.45 104.30±7.33 101.74±1.66 103.80±1.09 97.98±1.59 101.87±1.92 102.60±1.14 100.02±1.32 105.10±0.70

2.5 各組大鼠不同時期臟器系數(shù)

四組動物連續(xù)給藥90、120 d后及停藥2周后13種臟器外觀正常，各組大鼠不同時期臟器系數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示：90 d后各劑量組腦系數(shù)和肺臟系數(shù)均增加；中、大劑量腎上腺系數(shù)減少；各劑量組睪丸系數(shù)均增加；中劑量組附睪系數(shù)增加；120 d后各劑量組腦系數(shù)均增加；心臟系數(shù)中劑量增加；肺臟系數(shù)中劑量增加。停藥2周，腎上腺系數(shù)中劑量減少；胸腺系數(shù)小劑量減少；卵巢系數(shù)均增加，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠不同時期臟器系數(shù)（±s，‰，n=10）

表5 各組大鼠不同時期臟器系數(shù)（±s，‰，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 時間 大腦 心臟 肝臟 脾臟 肺臟 腎臟正常組小劑量組中劑量組大劑量90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后6.802±1.985 4.334±0.419 5.340±1.343 5.248±0.459**5.742±0.298**5.554±0.385 5.272±0.22**6.708±1.046**5.795±0.857 5.290±0.387**5.732±0.805**6.030±0.113 3.394±0.122 3.180±0.201 3.618±0.54 3.448±0.300 3.246±0.076 3.406±0.22 3.622±0.281 4.058±1.163*3.550±0.28 3.942±0.325 3.624±0.607 3.695±0.16 29.028±1.898 31.886±3.595 32.674±6.482 30.692±3.491 34.64±1.932 29.310±2.247 30.184±0.871 31.900±4.429 32.102±3.952 32.666±2.354 29.820±3.409 30.875±1.817 1.816±0.363 1.820±0.218 2.144±0.325 1.870±0.277 1.570±0.151 1.768±0.195 2.034±0.130 1.780±0.216 1.882±0.160 1.718±0.211 1.604±0.280 1.805±0.176 3.674±1.709 5.166±0.311 4.666±1.877 6.828±1.507**5.436±0.555 5.342±0.450 6.242±0.628*6.356±0.642*5.390±0.070 7.064±1.528**5.942±0.651 6.220±0.761 3.222±0.379 3.010±0.412 3.732±0.630 3.456±0.251 3.046±0.342 3.298±0.350 3.036±0.145 3.406±0.438 3.407±0.131 3.090±0193 3.174±0.273 3.450±0.056組別 時間正常組小劑量組中劑量組大劑量90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后90 d后120 d后停藥2周后腎上腺 胸腺 子宮0.228±.0690 0.150±0.072 0.180±0.050 0.172±0.035 0.360±0.354 0.136±0.032 0.146±0.082*0.152±0.049 0.120±0.017*0.116±0.056**0.478±0.711 0.159±0.062 0.831±0.483 0.526±0.048 1.088±0.290 0.714±.3970 0.514±0.127 0.420±0.155**0.750±0.119 0.596±0.187 0.607±0.357 0.540±0.287 0.590±0.086 0.587±0.192 0.992±0.388 2.846±2.955 2.606±0.953 0.846±0.544 2.862±0.811 3.228±0.923 0.814±0.484 2.472±0.809 4.032±0.945 1.172±0.444 3.358±0.993 4.085±1.944卵巢 睪丸 附睪0.164±0.094 0.376±0.366 1.100±1.147 0.252±0.104 0.342±0.193 0.312±0.114*0.316±0.247 0.288±0.172 0.236±0.091*0.289±0.076 0.378±0.185 0.221±0.016*3.926±0.706 3.064±0.439 4.914±2.550 4.684±0.248*3.512±0.771 3.666±0.463 4.700±0.352**3.202±0.631 3.352±0.498 4.936±0.177**3.922±0.536 4.117±0.708 1.236±0.553 1.468±0.312 1.004±0.325 1.336±0.563 1.470±0.208 1.454±0.446 2.002±0.442**1.306±0.083 1.408±0.296 1.286±0.645 1.576±0.417 1.655±0.286

2.6 組織病理學檢查結(jié)果

光鏡檢查腦（大腦、小腦、腦干），脊髓（頸、胸、腰段），垂體，胸腺，甲狀腺，甲狀旁腺，食管，唾液腺，胃，小腸和大腸，肝臟，胰腺，腎臟，腎上腺，脾臟，心臟，氣管，肺臟，主動脈，雄性動物前列腺、睪丸及附睪，雌性動物乳腺、子宮及卵巢，膀胱，坐骨神經(jīng)，骨髓，淋巴結(jié)（局部淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)），給藥局部，均未發(fā)現(xiàn)有明顯病變。

3 討論

復方梔子油軟膠囊由藥食同源原料組成既安全又符合中藥組方理論。酸棗仁油、梔子油含有多種植物脂肪酸有關(guān)。超臨界CO2萃取的酸棗仁油、梔子油和柏子仁油組成較為簡單，主要成分為不飽和脂肪酸，占84.1%，且油酸和亞油酸為82%[5]。亞油酸在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成γ-亞麻酸、花生四烯酸等，花生四烯酸是人體中含量最高、分布最廣的一種多不飽和脂肪酸。在維持膜的物理特性和功能方面起著非常重要的作用，所以該復方具有廣泛的作用。

筆者在急性毒性試驗中，大鼠以40 mL/（kg·d）給予灌胃最大耐受量，14 d未見明顯的毒性。為了進一步考察其長期毒性，又做90、120 d連續(xù)給藥及停藥2周后實驗，對動物外觀、血常規(guī)、血生化等指標及13種臟器組織的毒性變化無明顯影響，其中該藥對肝功能的影響并不確定，其余指標顯示未見嚴重毒性作用。以上結(jié)果提示該藥劑符合臨床用藥安全標準[6]。

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[2]李寶莉，陳雅慧，胡銳，等.復方酸棗仁油梔子油對小鼠的鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥作用[J].南方醫(yī)科大學學報，2008，28（9）：1636-1639.

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[6]國家藥品監(jiān)督管理局.中藥新藥研究的技術(shù)要求[S].1999-11-12.