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    Neuregulin-1 在糖尿病大鼠心肌組織中的表達(dá)變化*

    2012-12-23 04:07:44龍啟成朱立光農(nóng)勤玲鄧天賜
    中國病理生理雜志 2012年1期
    關(guān)鍵詞:左室纖維化染色

    龍啟成, 桂 春△, 朱立光, 農(nóng)勤玲, 鄧 燕, 鄧天賜

    (廣西醫(yī)科大學(xué)1 第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,2 第一附屬醫(yī)院超聲診斷科,3 病理學(xué)教研室,廣西 南寧530021)

    糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的主要并發(fā)癥之一,它是指排除冠心病、瓣膜性心臟病和高血壓等因素,以左心室功能障礙為主的心肌病,其病理生理學(xué)改變包括代謝紊亂、心肌纖維化、心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、微血管和心臟自主神經(jīng)病變等。在DCM中,許多細(xì)胞因子都被激活,如血管緊張素II、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子和炎癥因子[1-3],而血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素-1 及相關(guān)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)明顯受損[4-5]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(neuregulin-1,NRG-1)是表皮生長因子家族的成員,其受體為酪氨酸激酶家族的跨膜受體ErbB。NRG-1/ErbB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在心血管系統(tǒng)的發(fā)育和成年心臟功能的維護(hù)中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明NRG-1 能促進(jìn)心肌細(xì)胞的生存[6],降低氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖和對心臟損傷進(jìn)行修復(fù)[7]。NRG1/ErbB 系統(tǒng)是否參與DCM 的發(fā)展尚不明確。本研究以糖尿病大鼠為對象,探討NRG-1 在糖尿病大鼠心肌中的表達(dá)變化。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物

    采用8 周齡雄性SD 大鼠,體重180 ~200 g,屬于無特定病原體(SPF)級動(dòng)物,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證編號為SCXK 桂2009-0002)。

    2 主要試劑及儀器

    鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma,多克隆羊抗NRG-1 抗體和羊抗兔IgG-HRP 抗體分別購自Abcam 和Bioworld Technology,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol 購自Fermentas,2 ×Taq PCR Master Mix 和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體分別購自北京天根公司和上??党缮锕?。血糖儀和心臟實(shí)時(shí)三維超聲診斷儀分別購自羅氏有限公司和飛利浦公司。

    3 方法

    3.1 動(dòng)物分組與模型的建立 45 只SD 大鼠按電腦隨機(jī)數(shù)法分為4 周、8 周和12 周糖尿病組(4th、8th和12th DM 組,各組n=10),4 周、8 周和12 周對照組(4th、8th 和12th C 組,各組n=5)。禁食12 h 后,各DM 組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射STZ 溶液55 mg/kg(檸檬酸鹽緩沖液溶解,pH 4.3,濃度為10 g/L);各C 組大鼠注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。7 d 后取鼠尾靜脈血測空腹血糖。參考文獻(xiàn)[8],血糖大于16.7 mmol/L 并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦者納入DM模型。

    3.2 心功能測定和取材 實(shí)驗(yàn)的第4、8 和12 周,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉后,采用超聲診斷儀盲法檢測大鼠左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular systolic dimension,LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS),取5 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。完成心功能檢測后,處死大鼠,分離出左室心肌組織,于左室赤道面橫切,取適量心肌組織分別放入液氮灌和4%甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

    3.3 心肌膠原纖維染色(Masson 染色)及免疫組化染色 4%甲醛溶液固定的心肌組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋后,分別在心尖、中部和基底部以厚度4 μm 各連續(xù)切片2 張,其中不同部位的3 張行Masson 染色,光鏡下每個(gè)標(biāo)本選取5 個(gè)視野,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(心肌膠原容積分?jǐn)?shù)=視野中膠原面積/視野心肌總面積)。余下3 張用梯度酒精脫蠟和水化后,0.01 mmol/L PBS 洗2 次,滴加3%過氧化氫,室溫孵育10 min,PBS 洗3 次,切片置修復(fù)液中微波爐加熱10 s,PBS 洗2 次。滴加封閉液,置于濕盒中封閉60 min,分別加入1∶75 稀釋的NRG-1 抗體,4 ℃過夜。用PBS 洗3 次后滴加SABC 試劑免疫組化染色,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,封片。光鏡下以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染成密集棕黃色為陽性,散在淡棕黃色為弱陽性,無棕黃色為陰性。

    3.4 左室心肌組織NRG-1 mRNA 表達(dá)的測定

    取出液氮保存的心肌組織,先用Trizol 提取標(biāo)本的總RNA,測定總RNA 的濃度,再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,最后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物根據(jù)GenBank 提供的基因序列,使用Primer Design 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),由上海生工公司合成,見表1。RT-PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃45 s,55 ℃30 s,72 ℃30 s,擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán),最后72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描,以β-actin 為內(nèi)參照,比較各組NRG-1 mRNA 表達(dá)的變化。

    表1 RT-PCR 引物序列Table 1. The sequences of RT-PCR primers

    3.5 左室心肌組織NRG-1 蛋白表達(dá)的測定

    Western blotting 方法測定心肌組織NRG-1 蛋白的表達(dá)。取心肌組織約50 mg,加入RIPA 蛋白裂解液400 μL 和PMSF 4 μL 進(jìn)行總蛋白的提取,BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定樣本蛋白的濃度。蛋白于12%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳70 min,濕法電轉(zhuǎn)2 h 轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PDVF)膜后,剪出目的條帶,以6%脫脂奶封閉1.5 h,再加NRG-1 Ⅰ抗(1∶350)進(jìn)行抗體結(jié)合,4 ℃過夜,TBST 洗膜后加羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)室溫下孵育1 h,TBST 洗膜后滴加ECL 檢測試劑混合液在暗室中顯影。以GAPDH(1∶10 000)為內(nèi)參抗體。用Quantity One 成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析,以NRG-1 蛋白與GAPDH 蛋白條帶的灰度積分比值來代表目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量,分析結(jié)果。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較用t 檢驗(yàn),以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 動(dòng)物模型建立的情況

    DM 組不達(dá)標(biāo)大鼠4 只。飼養(yǎng)過程中死亡6 只均為糖尿病大鼠,可能死于感染或糖尿病高滲昏迷。最終4th、8th 和12th C 組均為5 只,4th 和8th DM 組各7 只,12th DM 組6 只。

    2 大鼠心功能檢測情況

    4th DM 組大鼠心功能指標(biāo)與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P >0.05);8th DM 組LVESD顯著高于同期對照組(P <0.05),而LVEDD、LVFS和LVEF 均較同期對照組稍低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P >0.05);12th DM 組LVESD 顯著高于同期對照組,LVEDD、LVFS 和LVEF 均顯著低于同期對照組,見表2。

    表2 各組大鼠的心功能檢測指標(biāo)的比較Table 2. The echocardiographic parameters of rats in each group(±s)

    表2 各組大鼠的心功能檢測指標(biāo)的比較Table 2. The echocardiographic parameters of rats in each group(±s)

    * P <0.05,**P <0.01 vs control (C)group at the same time point.

    Group n LVEDD(mm) LVESD(mm) LVEF(%) LVFS(%)4.40 4th DM 7 5.54±0.29 2.57±0.35 82.70±4.29 52.80±3.89 8th C 5 6.18±0.38 3.02±0.27 84.30±2.46 51.40±4.23 8th DM 7 5.63±0.33 3.79±0.41* 82.50±3.24 48.30±6.50 12th C 5 6.99±0.32 3.01±0.32 83.60±2.97 53.30±8.37 12th DM 6 5.72±0.31* 3.79±0.39* 71.50±4.53** 40.10±3.91 4th C 5 5.81±0.37 2.61±0.24 83.90±3.13 51.20±**

    3 大鼠左室心肌組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

    3.1 Masson 染色及心肌膠原容積分?jǐn)?shù) 4th DM 組大鼠左室心肌組織經(jīng)Masson 染色在光鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯心肌間質(zhì)或微血管壁纖維化;8th 和12th DM 組在光鏡下可見心肌細(xì)胞空泡樣改變,心肌間質(zhì)和微血管壁纖維化明顯,粗大膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀排列紊亂,分布不均,顯天藍(lán)色。計(jì)算心肌CVF(%)發(fā)現(xiàn),4th DM 組心肌CVF 與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.90 ± 0.21 vs 2.09 ± 0.29,P >0.05);8th 和12th DM 組心肌CVF 均明顯高于同期對照組(10.23 ±2.69 vs 1.87 ±0.37,17.29 ±4.67 vs 1.99 ±0.41,均P <0.01),見圖1。

    Figure 1. Masson staining of left ventricular myocardial tissues (× 100)and myocardial tissue CVF of rats. A:4th control group;B:4th DM group;C:8th control group;D:8th DM group;E:12th control group;F:12th DM group. **P <0.01 vs control group at the same time point.圖1 大鼠左室心肌Masson 染色圖像及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)

    3.2 NRG-1 蛋白在大鼠心肌組織中表達(dá)的部位

    免疫組化染色后,可見大鼠左室心內(nèi)膜、心肌內(nèi)層及微血管內(nèi)膜呈棕黃色即NRG-1 表達(dá)呈陽性,其它區(qū)域無棕黃色著色或呈稀疏淺棕色,即NRG-1 表達(dá)陰性或弱陽性,見圖2。

    Figure 2. Expression of NRG-1 protein in rat myocardial tissues (immunohistochemical staining,×100)圖2 NRG-1 蛋白在大鼠心肌組織中的表達(dá)

    4 左室心肌組織NRG-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)

    RT-PCR 和Western blotting 結(jié)果顯示,4th 和8th DM 組大鼠左室心肌組織NRG-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),12th DM 組心肌組織NRG-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)較同期對照組均顯著下調(diào)(均P <0.01),見圖3、4。

    Figure 3. The expression of NRG-1 mRNA in myocardial tissues of rats at different time points. M:marker;a:4th C group;b:4th DM group;c:8th C group;d:8th DM group;e:12th C group;f:12th DM group. **P <0.01 vs 12th C group. C:control;DM:diabetes mellitus.圖3 大鼠不同時(shí)期心肌NRG-1 mRNA 表達(dá)的比較

    討 論

    本研究發(fā)現(xiàn):(1)在糖尿病早期,大鼠心臟結(jié)構(gòu)即發(fā)生改變,心肌肥大,并逐漸出現(xiàn)纖維化;(2)隨著病程的發(fā)展,糖尿病大鼠出現(xiàn)心功能不全,并逐漸惡化;(3)在糖尿病的早期,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)無明顯改變,而隨著病程的發(fā)展,NRG-1 的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)。

    Figure 4. The expression of NRG-1 protein in myocardial tissues of rats (Western blotting). 1:4th C group;2:4th DM group;3:8th C group;4:8th DM group;5 and 7:12th C group;6 and 8:12th DM group. **P <0.01 vs 12th C group.圖4 NRG-1 蛋白在大鼠心肌組織中表達(dá)水平的比較

    DCM 主要表現(xiàn)為心肌肥大、纖維化,心肌順應(yīng)性下降,并逐漸出現(xiàn)心功能障礙。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 周后大鼠出現(xiàn)心肌肥大,隨后心肌纖維化,并逐漸出現(xiàn)心功能不全,說明大鼠已并發(fā)DCM。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生在誘導(dǎo)糖尿病后4 ~6周[9],與本研究觀察結(jié)果一致。許多因素可影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能,包括代謝紊亂、氧化應(yīng)激、微血管和心臟自主神經(jīng)病變等。有研究表明,高血糖引發(fā)氧化應(yīng)激可提高晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體的表達(dá),激活核轉(zhuǎn)錄因子,改變心肌收縮力;同時(shí),晚期糖基化終產(chǎn)物積聚還可改變心臟結(jié)構(gòu)蛋白,導(dǎo)致心臟I 型和Ⅲ型膠原沉積誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化[10],支持本研究結(jié)果。

    本研究免疫組化染色結(jié)果提示,NRG-1 主要在微血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞較多的心內(nèi)膜中表達(dá),與NRG-1 主要由心內(nèi)膜和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放相吻合[6]。有研究顯示左室組織NRG-1的表達(dá)在左室發(fā)生向心性肥厚的初期顯著升高,而當(dāng)左室出現(xiàn)偏心性肥厚和泵衰竭時(shí)顯著下降[6]。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 或8 周后,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)并未發(fā)生明顯改變,而在誘導(dǎo)糖尿病12周后,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)顯著下調(diào)。NRG-1 的合成與表達(dá)受許多神經(jīng)-體液因素影響。有研究表明,在DCM 中,心臟內(nèi)皮素-1 的表達(dá)、氧化應(yīng)激及活性氧產(chǎn)物增加[11],這些因素可提高內(nèi)皮細(xì)胞NRG-1 的表達(dá)[7,12]。另一方面,DCM 可引起交感神經(jīng)興奮和腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活[1],去甲腎上腺素和血管緊張素II 分泌增多,二者均可抑制NRG-1 的表達(dá)[6]。同時(shí),DCM 心臟微血管減少[11]而內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加[13],造成NRG-1 的來源減少。因此,推測在糖尿病早期,促進(jìn)NRG-1 表達(dá)的因素占優(yōu)勢,心肌組織NRG-1 的表達(dá)并未降低;而在糖尿病晚期,抑制NRG-1 表達(dá)的因素占優(yōu)勢,故心肌組織NRG-1 的表達(dá)顯著下調(diào)。

    許多生物學(xué)過程都由NRG1/ErbB 信號系統(tǒng)調(diào)節(jié),包括細(xì)胞生長、生存、增殖、遷移和分化,細(xì)胞與間質(zhì)的聯(lián)系等[7]。NRG-1/ErbB 系統(tǒng)在成年心臟功能的維護(hù)中扮演著至關(guān)重要的角色。抑制ErbB2/NRG 信號系統(tǒng)可增強(qiáng)紫杉醇對成年大鼠心臟毒性作用,導(dǎo)致心肌纖維化和心功能不全[14],而外源性NRG-1 可改善缺血性、擴(kuò)張型心肌病及病毒性心肌病模型的心功能,延長存活時(shí)間和減輕病理改變[15]。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 和8 周后,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)均未發(fā)生明顯改變,其心功能也處于代償期;而在誘導(dǎo)糖尿病12 周后,伴隨著NRG-1表達(dá)的顯著下調(diào),大鼠心肌纖維化更明顯,并出現(xiàn)心功能不全的表現(xiàn),提示NRG-1 表達(dá)減少可能與心肌纖維化及心功能不全的發(fā)生發(fā)展存在著一定聯(lián)系,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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