• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Neuregulin-1 在糖尿病大鼠心肌組織中的表達(dá)變化*

    2012-12-23 04:07:44龍啟成朱立光農(nóng)勤玲鄧天賜
    中國病理生理雜志 2012年1期
    關(guān)鍵詞:左室纖維化染色

    龍啟成, 桂 春△, 朱立光, 農(nóng)勤玲, 鄧 燕, 鄧天賜

    (廣西醫(yī)科大學(xué)1 第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,2 第一附屬醫(yī)院超聲診斷科,3 病理學(xué)教研室,廣西 南寧530021)

    糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的主要并發(fā)癥之一,它是指排除冠心病、瓣膜性心臟病和高血壓等因素,以左心室功能障礙為主的心肌病,其病理生理學(xué)改變包括代謝紊亂、心肌纖維化、心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、微血管和心臟自主神經(jīng)病變等。在DCM中,許多細(xì)胞因子都被激活,如血管緊張素II、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子和炎癥因子[1-3],而血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素-1 及相關(guān)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)明顯受損[4-5]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(neuregulin-1,NRG-1)是表皮生長因子家族的成員,其受體為酪氨酸激酶家族的跨膜受體ErbB。NRG-1/ErbB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在心血管系統(tǒng)的發(fā)育和成年心臟功能的維護(hù)中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明NRG-1 能促進(jìn)心肌細(xì)胞的生存[6],降低氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖和對心臟損傷進(jìn)行修復(fù)[7]。NRG1/ErbB 系統(tǒng)是否參與DCM 的發(fā)展尚不明確。本研究以糖尿病大鼠為對象,探討NRG-1 在糖尿病大鼠心肌中的表達(dá)變化。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物

    采用8 周齡雄性SD 大鼠,體重180 ~200 g,屬于無特定病原體(SPF)級動(dòng)物,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證編號為SCXK 桂2009-0002)。

    2 主要試劑及儀器

    鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma,多克隆羊抗NRG-1 抗體和羊抗兔IgG-HRP 抗體分別購自Abcam 和Bioworld Technology,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol 購自Fermentas,2 ×Taq PCR Master Mix 和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體分別購自北京天根公司和上??党缮锕?。血糖儀和心臟實(shí)時(shí)三維超聲診斷儀分別購自羅氏有限公司和飛利浦公司。

    3 方法

    3.1 動(dòng)物分組與模型的建立 45 只SD 大鼠按電腦隨機(jī)數(shù)法分為4 周、8 周和12 周糖尿病組(4th、8th和12th DM 組,各組n=10),4 周、8 周和12 周對照組(4th、8th 和12th C 組,各組n=5)。禁食12 h 后,各DM 組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射STZ 溶液55 mg/kg(檸檬酸鹽緩沖液溶解,pH 4.3,濃度為10 g/L);各C 組大鼠注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。7 d 后取鼠尾靜脈血測空腹血糖。參考文獻(xiàn)[8],血糖大于16.7 mmol/L 并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦者納入DM模型。

    3.2 心功能測定和取材 實(shí)驗(yàn)的第4、8 和12 周,腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉后,采用超聲診斷儀盲法檢測大鼠左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular systolic dimension,LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS),取5 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。完成心功能檢測后,處死大鼠,分離出左室心肌組織,于左室赤道面橫切,取適量心肌組織分別放入液氮灌和4%甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

    3.3 心肌膠原纖維染色(Masson 染色)及免疫組化染色 4%甲醛溶液固定的心肌組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋后,分別在心尖、中部和基底部以厚度4 μm 各連續(xù)切片2 張,其中不同部位的3 張行Masson 染色,光鏡下每個(gè)標(biāo)本選取5 個(gè)視野,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(心肌膠原容積分?jǐn)?shù)=視野中膠原面積/視野心肌總面積)。余下3 張用梯度酒精脫蠟和水化后,0.01 mmol/L PBS 洗2 次,滴加3%過氧化氫,室溫孵育10 min,PBS 洗3 次,切片置修復(fù)液中微波爐加熱10 s,PBS 洗2 次。滴加封閉液,置于濕盒中封閉60 min,分別加入1∶75 稀釋的NRG-1 抗體,4 ℃過夜。用PBS 洗3 次后滴加SABC 試劑免疫組化染色,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,封片。光鏡下以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染成密集棕黃色為陽性,散在淡棕黃色為弱陽性,無棕黃色為陰性。

    3.4 左室心肌組織NRG-1 mRNA 表達(dá)的測定

    取出液氮保存的心肌組織,先用Trizol 提取標(biāo)本的總RNA,測定總RNA 的濃度,再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,最后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物根據(jù)GenBank 提供的基因序列,使用Primer Design 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),由上海生工公司合成,見表1。RT-PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃45 s,55 ℃30 s,72 ℃30 s,擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán),最后72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描,以β-actin 為內(nèi)參照,比較各組NRG-1 mRNA 表達(dá)的變化。

    表1 RT-PCR 引物序列Table 1. The sequences of RT-PCR primers

    3.5 左室心肌組織NRG-1 蛋白表達(dá)的測定

    Western blotting 方法測定心肌組織NRG-1 蛋白的表達(dá)。取心肌組織約50 mg,加入RIPA 蛋白裂解液400 μL 和PMSF 4 μL 進(jìn)行總蛋白的提取,BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定樣本蛋白的濃度。蛋白于12%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳70 min,濕法電轉(zhuǎn)2 h 轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PDVF)膜后,剪出目的條帶,以6%脫脂奶封閉1.5 h,再加NRG-1 Ⅰ抗(1∶350)進(jìn)行抗體結(jié)合,4 ℃過夜,TBST 洗膜后加羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)室溫下孵育1 h,TBST 洗膜后滴加ECL 檢測試劑混合液在暗室中顯影。以GAPDH(1∶10 000)為內(nèi)參抗體。用Quantity One 成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析,以NRG-1 蛋白與GAPDH 蛋白條帶的灰度積分比值來代表目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量,分析結(jié)果。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較用t 檢驗(yàn),以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 動(dòng)物模型建立的情況

    DM 組不達(dá)標(biāo)大鼠4 只。飼養(yǎng)過程中死亡6 只均為糖尿病大鼠,可能死于感染或糖尿病高滲昏迷。最終4th、8th 和12th C 組均為5 只,4th 和8th DM 組各7 只,12th DM 組6 只。

    2 大鼠心功能檢測情況

    4th DM 組大鼠心功能指標(biāo)與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P >0.05);8th DM 組LVESD顯著高于同期對照組(P <0.05),而LVEDD、LVFS和LVEF 均較同期對照組稍低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P >0.05);12th DM 組LVESD 顯著高于同期對照組,LVEDD、LVFS 和LVEF 均顯著低于同期對照組,見表2。

    表2 各組大鼠的心功能檢測指標(biāo)的比較Table 2. The echocardiographic parameters of rats in each group(±s)

    表2 各組大鼠的心功能檢測指標(biāo)的比較Table 2. The echocardiographic parameters of rats in each group(±s)

    * P <0.05,**P <0.01 vs control (C)group at the same time point.

    Group n LVEDD(mm) LVESD(mm) LVEF(%) LVFS(%)4.40 4th DM 7 5.54±0.29 2.57±0.35 82.70±4.29 52.80±3.89 8th C 5 6.18±0.38 3.02±0.27 84.30±2.46 51.40±4.23 8th DM 7 5.63±0.33 3.79±0.41* 82.50±3.24 48.30±6.50 12th C 5 6.99±0.32 3.01±0.32 83.60±2.97 53.30±8.37 12th DM 6 5.72±0.31* 3.79±0.39* 71.50±4.53** 40.10±3.91 4th C 5 5.81±0.37 2.61±0.24 83.90±3.13 51.20±**

    3 大鼠左室心肌組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

    3.1 Masson 染色及心肌膠原容積分?jǐn)?shù) 4th DM 組大鼠左室心肌組織經(jīng)Masson 染色在光鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯心肌間質(zhì)或微血管壁纖維化;8th 和12th DM 組在光鏡下可見心肌細(xì)胞空泡樣改變,心肌間質(zhì)和微血管壁纖維化明顯,粗大膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀排列紊亂,分布不均,顯天藍(lán)色。計(jì)算心肌CVF(%)發(fā)現(xiàn),4th DM 組心肌CVF 與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.90 ± 0.21 vs 2.09 ± 0.29,P >0.05);8th 和12th DM 組心肌CVF 均明顯高于同期對照組(10.23 ±2.69 vs 1.87 ±0.37,17.29 ±4.67 vs 1.99 ±0.41,均P <0.01),見圖1。

    Figure 1. Masson staining of left ventricular myocardial tissues (× 100)and myocardial tissue CVF of rats. A:4th control group;B:4th DM group;C:8th control group;D:8th DM group;E:12th control group;F:12th DM group. **P <0.01 vs control group at the same time point.圖1 大鼠左室心肌Masson 染色圖像及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)

    3.2 NRG-1 蛋白在大鼠心肌組織中表達(dá)的部位

    免疫組化染色后,可見大鼠左室心內(nèi)膜、心肌內(nèi)層及微血管內(nèi)膜呈棕黃色即NRG-1 表達(dá)呈陽性,其它區(qū)域無棕黃色著色或呈稀疏淺棕色,即NRG-1 表達(dá)陰性或弱陽性,見圖2。

    Figure 2. Expression of NRG-1 protein in rat myocardial tissues (immunohistochemical staining,×100)圖2 NRG-1 蛋白在大鼠心肌組織中的表達(dá)

    4 左室心肌組織NRG-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)

    RT-PCR 和Western blotting 結(jié)果顯示,4th 和8th DM 組大鼠左室心肌組織NRG-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),12th DM 組心肌組織NRG-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)較同期對照組均顯著下調(diào)(均P <0.01),見圖3、4。

    Figure 3. The expression of NRG-1 mRNA in myocardial tissues of rats at different time points. M:marker;a:4th C group;b:4th DM group;c:8th C group;d:8th DM group;e:12th C group;f:12th DM group. **P <0.01 vs 12th C group. C:control;DM:diabetes mellitus.圖3 大鼠不同時(shí)期心肌NRG-1 mRNA 表達(dá)的比較

    討 論

    本研究發(fā)現(xiàn):(1)在糖尿病早期,大鼠心臟結(jié)構(gòu)即發(fā)生改變,心肌肥大,并逐漸出現(xiàn)纖維化;(2)隨著病程的發(fā)展,糖尿病大鼠出現(xiàn)心功能不全,并逐漸惡化;(3)在糖尿病的早期,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)無明顯改變,而隨著病程的發(fā)展,NRG-1 的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)。

    Figure 4. The expression of NRG-1 protein in myocardial tissues of rats (Western blotting). 1:4th C group;2:4th DM group;3:8th C group;4:8th DM group;5 and 7:12th C group;6 and 8:12th DM group. **P <0.01 vs 12th C group.圖4 NRG-1 蛋白在大鼠心肌組織中表達(dá)水平的比較

    DCM 主要表現(xiàn)為心肌肥大、纖維化,心肌順應(yīng)性下降,并逐漸出現(xiàn)心功能障礙。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 周后大鼠出現(xiàn)心肌肥大,隨后心肌纖維化,并逐漸出現(xiàn)心功能不全,說明大鼠已并發(fā)DCM。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生在誘導(dǎo)糖尿病后4 ~6周[9],與本研究觀察結(jié)果一致。許多因素可影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能,包括代謝紊亂、氧化應(yīng)激、微血管和心臟自主神經(jīng)病變等。有研究表明,高血糖引發(fā)氧化應(yīng)激可提高晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體的表達(dá),激活核轉(zhuǎn)錄因子,改變心肌收縮力;同時(shí),晚期糖基化終產(chǎn)物積聚還可改變心臟結(jié)構(gòu)蛋白,導(dǎo)致心臟I 型和Ⅲ型膠原沉積誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化[10],支持本研究結(jié)果。

    本研究免疫組化染色結(jié)果提示,NRG-1 主要在微血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞較多的心內(nèi)膜中表達(dá),與NRG-1 主要由心內(nèi)膜和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放相吻合[6]。有研究顯示左室組織NRG-1的表達(dá)在左室發(fā)生向心性肥厚的初期顯著升高,而當(dāng)左室出現(xiàn)偏心性肥厚和泵衰竭時(shí)顯著下降[6]。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 或8 周后,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)并未發(fā)生明顯改變,而在誘導(dǎo)糖尿病12周后,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)顯著下調(diào)。NRG-1 的合成與表達(dá)受許多神經(jīng)-體液因素影響。有研究表明,在DCM 中,心臟內(nèi)皮素-1 的表達(dá)、氧化應(yīng)激及活性氧產(chǎn)物增加[11],這些因素可提高內(nèi)皮細(xì)胞NRG-1 的表達(dá)[7,12]。另一方面,DCM 可引起交感神經(jīng)興奮和腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活[1],去甲腎上腺素和血管緊張素II 分泌增多,二者均可抑制NRG-1 的表達(dá)[6]。同時(shí),DCM 心臟微血管減少[11]而內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加[13],造成NRG-1 的來源減少。因此,推測在糖尿病早期,促進(jìn)NRG-1 表達(dá)的因素占優(yōu)勢,心肌組織NRG-1 的表達(dá)并未降低;而在糖尿病晚期,抑制NRG-1 表達(dá)的因素占優(yōu)勢,故心肌組織NRG-1 的表達(dá)顯著下調(diào)。

    許多生物學(xué)過程都由NRG1/ErbB 信號系統(tǒng)調(diào)節(jié),包括細(xì)胞生長、生存、增殖、遷移和分化,細(xì)胞與間質(zhì)的聯(lián)系等[7]。NRG-1/ErbB 系統(tǒng)在成年心臟功能的維護(hù)中扮演著至關(guān)重要的角色。抑制ErbB2/NRG 信號系統(tǒng)可增強(qiáng)紫杉醇對成年大鼠心臟毒性作用,導(dǎo)致心肌纖維化和心功能不全[14],而外源性NRG-1 可改善缺血性、擴(kuò)張型心肌病及病毒性心肌病模型的心功能,延長存活時(shí)間和減輕病理改變[15]。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 和8 周后,大鼠心肌組織NRG-1 的表達(dá)均未發(fā)生明顯改變,其心功能也處于代償期;而在誘導(dǎo)糖尿病12 周后,伴隨著NRG-1表達(dá)的顯著下調(diào),大鼠心肌纖維化更明顯,并出現(xiàn)心功能不全的表現(xiàn),提示NRG-1 表達(dá)減少可能與心肌纖維化及心功能不全的發(fā)生發(fā)展存在著一定聯(lián)系,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    [1] Belmadani S,Bernal J,Wei CC,et al. A thrombospondin-1 antagonist of transforming growth factor-β activation blocks cardiomyopathy in rats with diabetes and elevated angiotensin II[J]. Am J Pathol,2007,171(3):777-789.

    [2] Connelly KA,Kelly DJ,Zhang Y,et al. Functional,structural and molecular aspects of diastolic heart failure in the diabetic (mRen-2)27 rat[J]. Cardiovasc Res,2007,76(2):280-291.

    [3] Drimal J,Knezl V,Navarova J,et al. Role of inflammatory cytokines and chemoattractants in the rat model of streptozotocin-induced diabetic heart failure[J]. Endocr Requl,2008,42(4):129-135.

    [4] Han B,Baliga R,Huang H,et al. Decreased cardiac expression of vascular endothelial growth factor and redox imbalance in murine diabetic cardiomyopathy[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,297(2):H829-H835.

    [5] Chen JX,Stinnett A. Disruption of Ang-1/Tie-2 signaling contributes to the impaired myocardial vascular maturation and angiogenesis in type II diabetic mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(9):1606-1613.

    [6] Lemmens K,Segers VF,Demolder M,et al. Role of neuregulin-1/ErbB2 signaling in endothelium-cardiomyocyte cross-talk[J]. J Biol Chem,2006,281(28):19469-19477.

    [7] Zhao YY,Sawyer DR,Baliga RR,et al. Neuregulins promote survival and growth of cardiac myocytes. Persistence of ErbB2 and ErbB4 expression in neonatal and adult ventricular myocytes[J]. J Biol Chem,1998,273(17):10261-10269.

    [8] Matteucci E,Giampietro O. Proposal open for discussion:defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research[J]. J Ethnopharmacol,2008,115(2):163-172.

    [9] 衛(wèi) 峰,寧 光.糖尿病與心血管疾病——基礎(chǔ)和臨床[M].第1 版.上海:上??萍冀逃霭嫔?,2006.218-222.

    [10] Ma H,Li SY,Xu P,et al. Advanced glycation endproduct(AGE)accumulation and AGE receptor (RAGE)up-regulation contribute to the onset of diabetic cardiomyopathy[J]. J Cell Mol Med,2009,13(8B):1751-1764.

    [11] Widyantoro B,Emoto N,Nakayama K,et al. Endothelial cell- derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition[J]. Circulation,2010,121(22):2407-2418.

    [12] Kuramochi Y,Cote GM,Guo X,et al. Cardiac endothelial cells regulate reactive oxygen species-induced cardiomyocyte apoptosis through neuregulin-1β/erbB4 signaling[J]. J Biol Chem,2004,279(49):51141-51147.

    [13] Ceriello A,Quagliaro LD,Amico M,et al. Acute hyperglycemia induces nitrotyrosine formation and apoptosis in perfused heart from rat diabetes[J]. Diabetes,2002,51(4):1076-1082.

    [14] Pentassuglia L,Timolati F,Seifriz F,et al. Inhibition of ErbB2/neuregulin signaling augments paclitaxel-induced cardiotoxicity in adult ventricular myocytes[J]. Exp Cell Res,2007,313(8):1588-1601.

    [15] Liu X,Gu X,Li Z,et al. Neuregulin-1/erbB-activation improves cardiac function and survival in models of ischemic,dilated,and viral cardiomyopathy[J]. J Am Coll Cardiol,2006,48(7):1438-1447.

    猜你喜歡
    左室纖維化染色
    肝纖維化無創(chuàng)診斷研究進(jìn)展
    傳染病信息(2022年3期)2022-07-15 08:24:28
    心臟超聲配合BNP水平測定在高血壓左室肥厚伴心力衰竭診斷中的應(yīng)用
    肝纖維化的中醫(yī)藥治療
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:16
    血漿corin、NEP、BNP與心功能衰竭及左室收縮功能的相關(guān)性
    平面圖的3-hued 染色
    簡單圖mC4的點(diǎn)可區(qū)別V-全染色
    益腎活血法治療左室射血分?jǐn)?shù)正常心力衰竭的療效觀察
    油紅O染色在斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
    腎纖維化的研究進(jìn)展
    兩類冪圖的強(qiáng)邊染色
    亚洲性久久影院| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩精品有码人妻一区| 大陆偷拍与自拍| 国产精品久久久久久久久免| 精品少妇久久久久久888优播| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜精品国产一区二区电影| videossex国产| 五月玫瑰六月丁香| 一区二区三区精品91| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲成国产人片在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 如何舔出高潮| 国产在视频线精品| 国国产精品蜜臀av免费| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 午夜免费观看性视频| 18禁动态无遮挡网站| 九色亚洲精品在线播放| 人人澡人人妻人| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品久久久久久久电影| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲成人一二三区av| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久人妻精品一区果冻| 日本wwww免费看| a级毛片在线看网站| 岛国毛片在线播放| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品久久久精品久久久| 国产片内射在线| 一区在线观看完整版| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 99九九在线精品视频| 久久久久视频综合| 国产黄频视频在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品人妻久久久久久| 国产成人精品一,二区| 国产乱人偷精品视频| 在线 av 中文字幕| 久久97久久精品| 在线观看三级黄色| av免费观看日本| 大香蕉久久网| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| a 毛片基地| 91在线精品国自产拍蜜月| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日本色播在线视频| 永久免费av网站大全| 国产免费现黄频在线看| 国产av一区二区精品久久| 久久久久久人妻| 国产精品国产三级国产专区5o| 大片免费播放器 马上看| 日日爽夜夜爽网站| 多毛熟女@视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 五月天丁香电影| 久久韩国三级中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | a级片在线免费高清观看视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲成人一二三区av| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国精品久久久久久国模美| 免费av中文字幕在线| 草草在线视频免费看| 国产 一区精品| 精品福利永久在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品,欧美精品| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩电影二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美激情 高清一区二区三区| 考比视频在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 国产伦理片在线播放av一区| 黄色一级大片看看| 亚洲,欧美,日韩| 久久久久国产网址| 免费高清在线观看日韩| 男女下面插进去视频免费观看 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 色吧在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 精品一区在线观看国产| 男女国产视频网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 观看美女的网站| 国产视频首页在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲av.av天堂| 成人国产av品久久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品酒店卫生间| 亚洲人成77777在线视频| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 18+在线观看网站| 国产精品人妻久久久久久| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产色爽女视频免费观看| 91成人精品电影| 亚洲第一av免费看| 自线自在国产av| 晚上一个人看的免费电影| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久人人97超碰香蕉20202| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 男人舔女人的私密视频| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品中文字幕在线视频| 婷婷色av中文字幕| 午夜影院在线不卡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 免费人成在线观看视频色| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美97在线视频| 人妻 亚洲 视频| 午夜福利乱码中文字幕| 免费看不卡的av| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久久久久久久久大奶| 99香蕉大伊视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产极品天堂在线| 香蕉国产在线看| 午夜av观看不卡| 九九在线视频观看精品| 岛国毛片在线播放| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产深夜福利视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 另类亚洲欧美激情| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 人成视频在线观看免费观看| 只有这里有精品99| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精品色激情综合| 九色成人免费人妻av| 制服人妻中文乱码| 中文字幕av电影在线播放| 久久午夜福利片| 女性被躁到高潮视频| 亚洲国产色片| 人妻系列 视频| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩视频在线欧美| videosex国产| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 午夜日本视频在线| 亚洲精品,欧美精品| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 69精品国产乱码久久久| 制服诱惑二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 新久久久久国产一级毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品.久久久| 欧美日韩成人在线一区二区| www.色视频.com| 十分钟在线观看高清视频www| 男女国产视频网站| 人妻人人澡人人爽人人| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日本欧美视频一区| 国产探花极品一区二区| 色94色欧美一区二区| 免费观看av网站的网址| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产亚洲精品久久久com| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产日韩欧美亚洲二区| 99国产精品免费福利视频| 国产熟女欧美一区二区| av网站免费在线观看视频| 欧美日韩视频精品一区| 美女国产视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 曰老女人黄片| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品456在线播放app| 中文字幕制服av| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲国产精品999| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产av新网站| 两个人看的免费小视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美成人午夜免费资源| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久久久久人妻| 日韩一区二区视频免费看| 欧美日韩综合久久久久久| 日本色播在线视频| 亚洲av福利一区| 亚洲成人手机| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 久久久久久人妻| 日本91视频免费播放| 亚洲精品一区蜜桃| 久久精品国产a三级三级三级| 男女午夜视频在线观看 | 日韩中字成人| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 男人爽女人下面视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 国产乱人偷精品视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 精品福利永久在线观看| 视频区图区小说| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 熟女人妻精品中文字幕| 秋霞在线观看毛片| 免费人成在线观看视频色| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av电影中文网址| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 91国产中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲综合色惰| 国产高清国产精品国产三级| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产色婷婷99| 免费大片黄手机在线观看| av网站免费在线观看视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 大香蕉97超碰在线| 中文字幕免费在线视频6| 一级爰片在线观看| 大香蕉久久网| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 99热网站在线观看| 国产综合精华液| 精品一区二区三区视频在线| 欧美成人午夜免费资源| 国产午夜精品一二区理论片| 日本黄大片高清| 26uuu在线亚洲综合色| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 婷婷色综合www| 99久久人妻综合| 亚洲性久久影院| 国产福利在线免费观看视频| 99热国产这里只有精品6| 国产成人a∨麻豆精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 美女中出高潮动态图| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品无大码| 久久久国产一区二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 熟女人妻精品中文字幕| videos熟女内射| 伦理电影大哥的女人| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲国产欧美在线一区| 久久 成人 亚洲| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品久久久av美女十八| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品久久久久久久电影| av播播在线观看一区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 人妻系列 视频| 久久久国产精品麻豆| 精品午夜福利在线看| 男人爽女人下面视频在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 一本色道久久久久久精品综合| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 色网站视频免费| 久久影院123| 丝袜喷水一区| 男人操女人黄网站| av不卡在线播放| 伦精品一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 咕卡用的链子| 午夜视频国产福利| 亚洲精品,欧美精品| 美女内射精品一级片tv| 亚洲第一av免费看| 日韩av不卡免费在线播放| 国产片内射在线| 涩涩av久久男人的天堂| 中文欧美无线码| 我要看黄色一级片免费的| 高清视频免费观看一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 中文天堂在线官网| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产xxxxx性猛交| 最新中文字幕久久久久| 欧美人与性动交α欧美软件 | 国产男人的电影天堂91| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品自拍成人| 热re99久久国产66热| 成年女人在线观看亚洲视频| 日本色播在线视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日本91视频免费播放| 男女下面插进去视频免费观看 | 色5月婷婷丁香| 成人国产av品久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99热6这里只有精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美xxⅹ黑人| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧美色中文字幕在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91精品伊人久久大香线蕉| 成人综合一区亚洲| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 街头女战士在线观看网站| 精品国产国语对白av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品一国产av| 亚洲四区av| 在线精品无人区一区二区三| 桃花免费在线播放| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲成色77777| 色哟哟·www| 久热久热在线精品观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产亚洲欧美精品永久| 久久99热6这里只有精品| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 高清黄色对白视频在线免费看| 视频中文字幕在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产成人精品无人区| 久久久久久久精品精品| 国产xxxxx性猛交| 一区二区av电影网| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲精品aⅴ在线观看| 最后的刺客免费高清国语| av视频免费观看在线观看| 色吧在线观看| 国产乱人偷精品视频| 久久久久精品久久久久真实原创| a级毛色黄片| 22中文网久久字幕| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 尾随美女入室| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美日韩av久久| 欧美日韩综合久久久久久| 精品久久国产蜜桃| 精品亚洲成国产av| 日本av免费视频播放| 我要看黄色一级片免费的| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜激情久久久久久久| 老熟女久久久| 欧美精品一区二区免费开放| 黄色视频在线播放观看不卡| 女性生殖器流出的白浆| 搡老乐熟女国产| 美女中出高潮动态图| 国产成人91sexporn| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久网色| 成人亚洲欧美一区二区av| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品自拍成人| 国产精品熟女久久久久浪| 国产av精品麻豆| 黄片播放在线免费| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久久伊人网av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 黄片无遮挡物在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲久久久国产精品| 黑人高潮一二区| 国产 精品1| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 69精品国产乱码久久久| 久久人人爽人人片av| 亚洲av日韩在线播放| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费在线观看完整版高清| 2018国产大陆天天弄谢| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美亚洲日本最大视频资源| 看十八女毛片水多多多| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜视频国产福利| 男女边吃奶边做爰视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲人与动物交配视频| 永久免费av网站大全| 成年人午夜在线观看视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲av.av天堂| 美女国产高潮福利片在线看| 五月开心婷婷网| 国产高清国产精品国产三级| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国产一区二区久久| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美精品一区二区免费开放| 蜜桃国产av成人99| 久久免费观看电影| 人妻少妇偷人精品九色| 伦理电影大哥的女人| 嫩草影院入口| 亚洲成人av在线免费| 美国免费a级毛片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 大香蕉97超碰在线| 日本黄大片高清| av电影中文网址| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久久久久久免费av| av卡一久久| 99视频精品全部免费 在线| 午夜91福利影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 成年人免费黄色播放视频| 久久97久久精品| 黄色配什么色好看| 国精品久久久久久国模美| 免费大片黄手机在线观看| 久久 成人 亚洲| 看十八女毛片水多多多| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av有码第一页| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲av电影在线进入| 最后的刺客免费高清国语| 香蕉丝袜av| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产亚洲最大av| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 老熟女久久久| 国产成人91sexporn| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 少妇人妻 视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 七月丁香在线播放| videos熟女内射| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产xxxxx性猛交| 高清av免费在线| 亚洲第一av免费看| 日韩大片免费观看网站| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲综合色网址| 精品人妻在线不人妻| 在线观看国产h片| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 欧美日韩成人在线一区二区| 妹子高潮喷水视频| 99香蕉大伊视频| 亚洲图色成人| av免费在线看不卡| 丝袜喷水一区| 中国三级夫妇交换| 久久久国产欧美日韩av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产一区有黄有色的免费视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜视频国产福利| 午夜久久久在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美精品av麻豆av| 亚洲性久久影院| 久久久久久久精品精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 美女大奶头黄色视频| 99热6这里只有精品| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| www.色视频.com| 青春草视频在线免费观看| 黑人高潮一二区| 另类亚洲欧美激情| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久av网站| 天美传媒精品一区二区| 看十八女毛片水多多多| 日韩免费高清中文字幕av| 免费观看在线日韩| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品无人区| 亚洲精品第二区| 欧美精品一区二区免费开放| 纯流量卡能插随身wifi吗| 成人国产av品久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品久久久久成人av| 国产成人精品久久久久久| 日韩一区二区三区影片| 街头女战士在线观看网站| 欧美丝袜亚洲另类| 精品国产一区二区久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 夫妻午夜视频| 色5月婷婷丁香| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久韩国三级中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| av在线播放精品| 久久久久国产网址| 日韩欧美精品免费久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| a级毛片黄视频| 一区二区三区精品91| 久久久久久人人人人人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 乱人伦中国视频| 又大又黄又爽视频免费| 在线观看人妻少妇| 男女边吃奶边做爰视频| 18禁国产床啪视频网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 91精品三级在线观看| 看免费av毛片| 亚洲中文av在线| 美女内射精品一级片tv| 久久人妻熟女aⅴ| 老司机影院成人| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品一区www在线观看| 精品福利永久在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产黄色免费在线视频| 久久久精品区二区三区| 国产成人aa在线观看| 久久久欧美国产精品| av国产精品久久久久影院| 九九在线视频观看精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日韩伦理黄色片| 成人综合一区亚洲| 视频中文字幕在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 99热全是精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久这里有精品视频免费| 高清不卡的av网站| 国产av码专区亚洲av| 麻豆乱淫一区二区| 国产一区二区在线观看av| 人妻 亚洲 视频| 91精品国产国语对白视频| 国产成人精品无人区| 欧美成人精品欧美一级黄|