橘皮黃酮提取的響應(yīng)面優(yōu)化及抗氧化活性研究*

王 芳， 淡小艷

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

柑橘是我國的主要水果之一，其產(chǎn)量居世界前列．橘皮約占柑橘質(zhì)量的20% ～40%，除含有精油、果膠、色素、檸檬苦素外，還含有豐富的黃酮類物質(zhì)［1-2］．大量研究證實了黃酮類物質(zhì)具有降血壓、防止動脈硬化、清除自由基、抗突變、抗氧化、抗真菌、抗衰老和抗腫瘤等多種作用［3-8］，具有很高的藥用價值．已鑒定出來大約60余種黃酮類化合物存在于柑橘中，其主要成分是黃烷酮、黃酮、黃酮醇等，它們大多以糖苷的形式存在［9-10］．目前，大部分橘皮被作為垃圾丟棄．開發(fā)橘皮黃酮，既能提高柑橘的經(jīng)濟效益，又能減緩橘皮廢棄帶來的環(huán)境污染［11-12］，具有廣闊的市場前景．

近年來，對橘皮黃酮的研究報道逐漸增多，在提取工藝方面主要集中在加熱回流提取法、微波提取法和超聲波提取法等［13］．加熱回流提取法會因長時間加熱而導致黃酮結(jié)構(gòu)破壞;微波提取法和超聲波提取法涉及設(shè)備昂貴、操作技術(shù)要求較高等因素，仍停留于實驗室研究階段．而溶劑提取法具有設(shè)備簡單、成本低、產(chǎn)量大的優(yōu)勢，可廣泛用于工業(yè)化生產(chǎn)．目前，對黃酮提取的超聲波和微波輔助提取的響應(yīng)面法優(yōu)化的報道較多［13］，而對浸提法的響應(yīng)面研究尚少見報道．本文運用響應(yīng)面法優(yōu)化了橘皮黃酮的提取工藝，用AB-8型大孔吸附樹脂為色譜柱填充料對橘皮黃酮提取物進行了純化，并對橘皮黃酮的抗氧化活性進行了考察，旨在為橘皮的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

供試柑橘購自浙江省金華市農(nóng)貿(mào)市場．實驗所用蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、牛血清蛋白購自Sigama公司．AB-8型大孔吸附樹脂購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司．其他試劑均為分析純．

料理機(九陽股份有限公司)，DZF-9140B型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，BT224s型電子天平(德國賽多利斯公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-1001(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，柱色譜裝置，UV1000紫外可見光光度計(上海天美科學儀器有限公司)，SC-5A超級恒溫槽(寧波海曙億恒儀器有限公司)．

1．2 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素實驗結(jié)果，分別選擇料液比(X1)、提取溫度(X2)和提取時間(X3)作為自變量，橘皮黃酮得率作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面實驗，因素和水平取值見表1．

表1 響應(yīng)面法實驗設(shè)計因素和水平

1．3 黃酮含量測定

對照文獻［6，14］．標準曲線的制作：稱取蘆丁20 mg，用10%乙醇溶液定容至25 mL，備用．取 7 支具塞試管，分別加入 0，0．5，1．0，1．5，2．0，2．5，3．0 mL蘆丁標準溶液，用30%乙醇溶液補足體積至5 mL，混勻，各加入0．3 mL 50 g/L NaNO2溶液，混勻，靜置 5 min，加 0．3 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，混勻后靜置 6 min，加入 4 mL 1 mol/L NaOH溶液，再加入0．4 mL 30%乙醇溶液使總體積為 10 mL，混勻后靜置 10 min，用UV1000紫外-可見分光光度計在510 nm處測量吸光度．以吸光度(A)為橫坐標，蘆丁質(zhì)量濃度(ρ蘆丁)為縱坐標繪制工作曲線．用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁濃度Y與吸光度值x的關(guān)系曲線，回歸方程為：Y=0．768x－0．001 2，相關(guān)系數(shù)R2=0．999 9．

同法測定樣品液中黃酮的含量為

其中：X是1 mL提取液中總黃酮的質(zhì)量(mg);Vt是提取液總體積(mL);Vs是測定用樣品液體積(mL);W是總質(zhì)量．

1．4 蛋白質(zhì)含量測定

參照文獻［15］．考馬斯亮藍G250溶液的配置：稱取100 mg考馬斯亮藍G250溶解于50 mL 90%乙醇溶液中，加入850 g/L磷酸溶液100 mL，用蒸餾水定容到1 000 mL，搖勻，放冰箱中備用．

標準曲線的制作：5 mg牛血清蛋白溶于100 mL水中，配成0．05 mg/mL牛血清蛋白溶液，分別取 0．4，0．8，1．2，1．6，2．0 mL 于 10 mL 具塞試管中，加水補足2 mL，然后加入5 mL考馬斯亮藍G250溶液，倒轉(zhuǎn)振蕩，放置2 min，用 UV1000紫外-可見分光光度計在595 nm處測量吸光度．以吸光度(A)為橫坐標，牛血清蛋白質(zhì)量濃度(ρ蛋白)為縱坐標繪制標準曲線．用最小二乘法作線性回歸，得牛血清蛋白溶液濃度Y與吸光度值x關(guān)系曲線的回歸方程為：Y=0．153 7x－0．004 1，相關(guān)系數(shù) R2=0．992．

樣品中蛋白質(zhì)含量測定同標準曲線的制作，根據(jù)所得吸光度計算蛋白質(zhì)的含量．

1．5 橘皮黃酮純化

大孔樹脂的處理：選用AB-8型大孔吸附樹脂對橘皮黃酮提取物進行純化．樹脂于95%乙醇溶液中浸泡26 h，用蒸餾水洗至無乙醇味為止，裝柱于2 cm×20 cm玻璃柱中．分別用100 mL 5%和2%的HCl溶液以2 mL/min的流速沖洗100 min，用蒸餾水以同樣流速沖洗至pH呈中性．

純化工藝［16］：將樣品用蒸餾水溶解，上樣濃度為100 mg/mL，上樣體積為5 mL．將上樣液緩慢加入色譜柱中，用蒸餾水洗5 min，使樣品充分分布在色譜柱中，靜止10 min，用100 mL蒸餾水以2 mL/min的流速洗脫雜質(zhì)，再用100 mL 20%乙醇溶液以同樣流速洗脫雜質(zhì)，最后用100 mL 95%乙醇溶液洗脫黃酮，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以65℃恒溫水浴進行減壓蒸餾，回收乙醇，得黃褐色膏狀物質(zhì)，真空干燥至恒重，測黃酮和蛋白質(zhì)的含量．

1．6 橘皮黃酮抗氧化活性測定

1．6．1 對DPPH自由基的清除能力

參照文獻［16］，精密稱取 12．0 mg DPPH，用無水乙醇定容于250 mL容量瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用．取待測樣品溶液2 mL，加入2 mL 0．2 mmol/L DPPH溶液，混勻，放置30 min，在517 nm處測其吸光度(Ai);以溶劑為參比，于517 nm處測定吸光度中：Ac為2 mL溶劑加2 mL DPPH溶液的吸光度;Ai為2 mL待測液加2 mL DPPH溶液的吸光度;Aj為2 mL待測液加2 mL溶劑的吸光度．

1．6．2 對羥自由基的清除能力

參照文獻［17］．在10 mL試管中依次加入2．5 mmol/L FeSO4溶液2 mL、不同濃度的黃酮溶液2 mL 和2．5 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，再加入2．5 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻靜置30 min后于510 nm處測其吸光度．清照;Ai為某質(zhì)量濃度黃酮溶液的吸光度;Aj為無水楊酸時黃酮溶液的吸光度．

2 結(jié)果與分析

2．1 橘皮黃酮提取的單因子實驗

2．1．1 提取溶劑的選擇

分別稱取干燥的柑橘皮粉0．5 g，按料液比為1 ∶30加入0%，20%，40%，60%，80%，95%的乙醇溶液，常溫下浸提2 h，比較不同的含醇量對橘皮黃酮得率的影響．實驗結(jié)果(見圖1)表明，隨著溶劑中乙醇含量的增大，橘皮黃酮的提取率降低，在乙醇含量為0(蒸餾水)時黃酮的提取效果最好，黃酮得率達到6．996 mg/g，可能是橘皮中的水溶性黃酮含量較高［18］所致．橘皮中的黃酮大多以糖苷的形式存在，糖苷的糖鏈越長，其水溶性越大［13］．考慮到蒸餾水比乙醇健康、安全、生產(chǎn)成本低，因此選擇蒸餾水作為橘皮中黃酮類物質(zhì)的提取溶劑．

圖1 溶劑含醇量對橘皮黃酮得率的影響

2．1．2 料液比的影響

圖2 料液比對橘皮黃酮得率的影響

分別稱取0．5 g柑橘皮粉，各加入蒸餾水10，15，20，25，30 和35 mL，在常溫下浸提2 h，考查不同料液比對橘皮黃酮得率的影響．由圖2可知：當料液比從1∶20改變到1∶40時，橘皮總黃酮的得率增加，因為溶劑用量的增加有利于黃酮向細胞外擴散［19］;當料液比為1∶40時，黃酮得率達到最大值11．211 mg/g;料液比為1 ∶40之后，黃酮得率趨于平穩(wěn)．考慮到：太大的液料比不利于樣品的干燥，且會造成生產(chǎn)成本增加;料液比為1∶30時黃酮得率達到10．729 mg/g，且料液比為1∶30和1∶40的黃酮提取率經(jīng)SPSS 16．0軟件的顯著性分析，結(jié)果是無顯著性差異，所以綜合考慮選擇1∶30的料液比．

2．1．3 溫度的影響

分別稱取0．5 g柑橘皮粉，按照1∶30的料液比加入蒸餾水，分別在20，40，60，80和100℃浸提2 h，比較不同提取溫度對橘皮黃酮得率的影響．在提取溫度為0～80℃時，黃酮提取率隨溫度升高而逐漸增大，在提取溫度為80～100℃時提取率急劇增加，提取溫度為100℃時提取率達到最大值10．200 mg/g(見圖3)．溫度升高在物質(zhì)交換過程中有利于物質(zhì)的溶解分配［1］，因而有利于黃酮在水中的溶解．綜合選擇100℃為橘皮黃酮的最優(yōu)浸提溫度．

圖3 提取溫度對橘皮黃酮得率的影響

2．1．4 提取時間的影響

分別稱取0．5 g柑橘皮粉，按照1∶30料液比加入蒸餾水，在100 ℃分別浸提 1，2，3，4，5和6 h，研究不同提取時間對橘皮黃酮得率的影響．實驗結(jié)果(見圖4)表明：提取時間在1～4 h內(nèi)橘皮黃酮的提取率增加，其原因在于提取時間的延長有利于黃酮的充分溶出;當提取時間為4 h時，黃酮得率達到最大值9．403 mg/g;而4 h后，隨著提取時間的延長，橘皮黃酮的提取率有所下降，因為提取時間太長會導致部分對熱不穩(wěn)定的黃酮被分解［19］，從而使總黃酮的提取率下降．經(jīng)過SPSS 16．0軟件的分析，提取時間為3 h和4 h無顯著性差異，為2 h和4 h則有顯著性差異．提取時間的增加會導致其他雜質(zhì)溶出量的增加，并且生產(chǎn)周期會延長，且長時間的高溫會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，所以綜合考慮選擇3 h為適宜的提取時間．

圖4 提取時間對橘皮黃酮得率的影響

2．2 橘皮黃酮提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

2．2．1 響應(yīng)面法實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因子實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面分析實驗，以料液比(X1)、提取溫度(X2)和提取時間(X3)為自變量，以橘皮黃酮的得率作為響應(yīng)值，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2．

2．2．2 響應(yīng)面及等高線分析

用Design Expert 8．0軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到二次回歸方程響應(yīng)面圖(見圖5～圖7)．

圖5～圖7可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響．比較3幅圖可知：料液比和提取溫度的交互作用對黃酮得率的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;而提取時間和料液比及提取時間和提取溫度的交互作用次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑．

2．2．3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果分析

根據(jù)表2的實驗數(shù)據(jù)，利用Design Expert 8．0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合后得到X1，X2和X3的二次多項回歸模型：橘皮黃酮得率=9．48+0．80X1+0．54X2+0．12X3+1．02X1X2－0．51X12－0．37X22+0．47X3

2．

對優(yōu)化后的回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3．該模型是極顯著的(P=0．007 8)，其中料液比和提取溫度對提取液中橘皮黃酮含量的影響較大，提取時間對提取液中黃酮含量的影響較?。讲罘治鲋幸淮雾梄1和X2對模型的影響顯著，X1和X2的交互項對模型的影響也達到極顯著．對回歸模型取一階偏導數(shù)等于零，可以得到曲面的最大點．對模型進行手動優(yōu)化，由原來3個交互項手動改為只增加X1X2交互項，優(yōu)化后的結(jié)果為：料液比為1 ∶37．84(g/mL)，提取溫度為99．15℃，提取時間為2．04 h．考慮到實際操作，則取料液比為1∶38(g/mL)，提取溫度為99℃，提取時間為2 h，此條件下橘皮黃酮的得率可達11．028 mg/g．優(yōu)化后實驗條件下的響應(yīng)面3D效果圖見圖8．

表2 響應(yīng)面法設(shè)計方案與實驗結(jié)果

圖5 料液比和提取溫度的交互作用

圖7 提取溫度和提取時間的交互作用

圖6 料液比和提取時間的交互作用

表3 優(yōu)化后回歸模型的方差分析

圖8 優(yōu)化條件下的交互作用圖

2．3 橘皮黃酮提取物中黃酮和蛋白質(zhì)的含量

用AB-8型大孔吸附樹脂對所得橘皮黃酮提取物進行純化，95%乙醇洗脫后濃縮干燥，得黃酮浸膏．將柱色譜前后所得黃酮浸膏均用水配制為10 mg/mL的溶液，測定純化前后浸膏中的黃酮含量和蛋白質(zhì)含量．

由圖9和圖10可以看出，AB-8大孔吸附樹脂對橘皮黃酮粗提物的純化效果明顯，純化前后提取物中黃酮含量由8．431 mg/g升高到40．748 mg/g，增加了 383．312%;蛋白質(zhì)含量由 3．791 mg/g 降低到1．908 mg/g，降低了 49．670%．

圖9 純化前后提取物中黃酮含量

圖10 純化前后提取物中蛋白質(zhì)含量

2．4 橘皮黃酮的抗氧化活性

2．4．1 對DPPH自由基的清除能力

圖11顯示了純化前后不同濃度的橘皮黃酮對DPPH自由基的清除能力，可以看出，橘皮黃酮對DPPH自由基的清除能力在一定范圍與樣品濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，當樣品濃度為4 mg/mL時，其對DPPH的清除率接近100%．經(jīng)過IC50計算小軟件計算得出，純化前橘皮黃酮對DPPH自由基的IC50為0．498 mg/mL，純化后橘皮黃酮對DPPH自由基的IC50為0．019 mg/mL，即清除能力較純化前提高了96．185%．

2．4．2 對羥自由基的清除能力

圖12顯示了純化前后不同濃度的橘皮黃酮對羥自由基的清除能力，可以看出，橘皮黃酮對羥自由基的清除能力在一定范圍與樣品濃度也呈劑量效應(yīng)關(guān)系，當濃度為4 mg/mL時，純化后的樣品對羥自由基的清除率接近100%．經(jīng)過IC50計算小軟件計算得出，純化前橘皮黃酮對羥自由基的IC50為1．597 mg/mL，純化后對羥自由基的 IC50為0．557 mg/mL，較純化前提高了65．122%．

圖11 橘皮黃酮對DPPH自由基的清除能力

圖12 橘皮黃酮對羥自由基的清除能力

3 結(jié)論

橘皮黃酮類化合物提取的最佳工藝條件是：溶劑為蒸餾水，料液比為1∶38(g/mL)，提取溫度為99℃，提取時間為2 h．該條件下橘皮黃酮的得率可達到11．028 mg/g．

AB-8型大孔吸附樹脂對橘皮黃酮類化合物的純化效果明顯，純化后橘皮黃酮的純度提高了383．312%，同時黃酮類化合物的抗氧化活性大大提高．

橘皮黃酮有明顯的抗氧化作用，且有劑量效應(yīng)關(guān)系，尤其是經(jīng)過純化工藝后的黃酮類化合物，其抗氧化效果顯著增加，對DPPH自由基和羥自由基的清除能力分別提高了 96．185%和65．122%，可以作為理想的天然抗氧化劑使用，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景．

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