慢性腦缺血大鼠海馬區(qū)Cdc42表達(dá)及其與認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性

李 星 張博愛 姬亞杰 劉榮麗 賈 賀 張小敏 劉 宇

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河南 鄭州 450052)

慢性腦缺血可由于長期腦低灌注狀態(tài)而導(dǎo)致持久性和進(jìn)展性的認(rèn)知功能障礙。目前對于其發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究較少。Cdc42作為Rho家族的一員，是肌動蛋白細(xì)胞骨架的重要調(diào)節(jié)子。它作為細(xì)胞內(nèi)“分子開關(guān)”在神經(jīng)元的發(fā)生、存活、遷移、神經(jīng)突起的生長和導(dǎo)向、突觸的形成和可塑性等方面均發(fā)揮重要的作用。實驗證明持久性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(2VO)術(shù)后8～12 w為腦缺血的慢性期，腦低血流轉(zhuǎn)為慢性狀態(tài)，這一期與人類老齡化和阿爾茨海默病(AD)、血管性癡呆(VD)狀態(tài)形成之腦低灌注狀態(tài)極其相似〔1〕。本實驗探討慢性腦缺血所致認(rèn)知功能障礙過程中Cdc42可能發(fā)生的作用及應(yīng)答機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 雄性SD大鼠＞12月齡(購自鄭州大學(xué)實驗動物中心);Cdc42羊多克隆抗體(sc-6083美國Santa Cruz公司);免疫組化試劑盒(PV-9003北京中杉金橋);DAB試劑盒(北京博奧森);組織裂解液(R0010北京索寶萊科技公司);Western二抗(北京中杉金橋);內(nèi)參β-actin(TA-09北京中杉金橋);ECL試劑盒(Pierce)。

1.2 動物模型的制備及分組 缺血模型組參照Ni等〔2〕的制作方法制備2VO模型，10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸前部去毛消毒;沿頸正中切開皮膚，小心分離出雙側(cè)頸總動脈;分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的遠(yuǎn)心端與近心端，從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流;縫合皮膚。術(shù)中大鼠肛溫保持在36.5～37.5℃。將造模成功大鼠分為2VO 8、10、12 w組。每組10只。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，余處理同模型組大鼠。

1.3 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮有圓形水池、自動攝像機(jī)及電腦分析系統(tǒng)組成。測試前將水注入池中，水深30 cm(即水面高出站臺表面1 cm，使大鼠不能見到站臺)，水溫控制在(26±1)℃。實驗在隔音、較暗的房間內(nèi)進(jìn)行，各種實驗條件保持不變。各組大鼠均在處死前5 d開始Morris水迷宮學(xué)習(xí)，選擇一個象限的固定位置將大鼠入水，以入水起至找到平臺的時間為逃避潛伏期，如在90 s內(nèi)未找到平臺，用棒將其引上平臺，并讓其站立10 s，潛伏期記為90 s。每天訓(xùn)練4次，上午2次，下午2次。第5天成績的平均值作為術(shù)前測試成績。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。測試結(jié)束后即行手術(shù)取腦。

1.4 腦組織切片的制備及Cdc42蛋白的免疫組織化學(xué)檢測分別取假手術(shù)組大鼠以及術(shù)后8、10、12 w模型組大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，250 ml生理鹽水(37℃)經(jīng)心臟灌注快速沖洗血細(xì)胞，用4%多聚甲醛(4℃)250 ml灌注。直到大鼠全身僵硬為止，開顱取出全腦，去掉腦干和小腦，4%多聚甲醛固定8 h，石蠟包埋后，3 μm厚連續(xù)切片。選擇海馬區(qū)的腦片，經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水、抗原熱修復(fù)，血清封閉液封閉，滴加Cdc42一抗(1∶70)4℃孵育過夜，試驗中選擇磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。然后參照二抗試劑盒(PV-9003)說明書操作，DAB顯色，于顯微鏡下控制反應(yīng)時間，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，樹脂封片。采用熒光倒置顯微鏡(德國 LEICA)，在400倍視野下觀察，計數(shù)5個不重復(fù)視野中的陽性細(xì)胞個數(shù)，取平均值。

1.5 蛋白樣品的制備及Cdc42蛋白的Western印跡檢測 分別取假手術(shù)組大鼠以及術(shù)后8、10、12 w模型組大鼠，水合氯醛腹腔麻醉后，迅速取腦，于冰上分離海馬。用生理鹽水沖洗后，迅速置于液氮罐中低溫保存。從液氮罐中取出海馬，置于勻漿器中，按照每100 mg組織加入1 ml裂解液的比例加入裂解液，于冰上研磨30 min，所得的裂解產(chǎn)物以4℃離心30 min，小心收集上清液。所得上清液加入上樣緩沖液后98℃變性5 min，根據(jù)蛋白定量或actin調(diào)整蛋白上樣量。后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度4%，分離膠濃度12%，然后半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電流為(0.8 mA/cm2)，脫脂奶粉封閉1 h，用1∶600的Cdc42一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min;加二抗?jié)舛?∶10 000，室溫孵育1.5 h，同上洗滌，內(nèi)參β-actin一抗1∶1 000室溫孵育1.5 h，內(nèi)參二抗1∶4 000室溫孵育1 h，ECL顯色，用X光片壓片并沖洗。掃描膠片上的條帶，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參actin灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 首先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，應(yīng)用SPSS13.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，用s表示。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮測試結(jié)果 假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期為(32.50±9.70)s，缺血8、10、12 w 組的潛伏期分別為(51.00 ±11.16)、(63.50±14.11)、(77.90 ±8.41)s，各組間差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明隨著慢性腦缺血時間的延長，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈明顯下降趨勢。

2.2 免疫組化檢測結(jié)果 如圖1所示。海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中均可見棕黃色顆粒，主要位于軸突和樹突中，說明均有Cdc42表達(dá);缺血8 w組Cdc42表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯減少，且隨缺血時間延長，陽性細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行性減少(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Cdc42的免疫組化染色結(jié)果(DAB染色，×400)

2.3 Western印跡檢測結(jié)果 如圖2所示，各組均可見Cdc42表達(dá)，缺血8 w組Cdc42的表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，且隨缺血時間延長其表達(dá)量進(jìn)行性減少(P＜0.05)。與免疫組化檢測結(jié)果一致。見表1。

表1 各組大鼠海馬區(qū)Cdc42表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)及Western印跡相對灰度值( s，n=10)

表1 各組大鼠海馬區(qū)Cdc42表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)及Western印跡相對灰度值( s，n=10)

與假手術(shù)組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與術(shù)后8 w組比較：3)P＜0.05，4)P ＜0.01;與術(shù)后10 w 組比較：5)P ＜0.05

組別 免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)(個)Western印跡相對灰度值(%)74.00±7.30 73.20±6.33 2VO術(shù)后8 w組 66.40±7.521) 64.60±8.191)2VO術(shù)后10 w組 57.30±7.322)3) 56.20±7.432)3)2VO術(shù)后12 w組 48.90±8.322)4)5) 48.60±8.382)4)5)假手術(shù)組

圖2 各組大鼠海馬區(qū)Cdc42的Western印跡檢測結(jié)果

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活、再生、遷移、分化均需要細(xì)胞骨架的參與。包括肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白之間的相互協(xié)調(diào)。Cdc42作為Rho家族中的重要一員，是肌動蛋白細(xì)胞骨架動力的重要調(diào)節(jié)子，且廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟神經(jīng)元中〔3〕。Cdc42信號途徑是經(jīng)由胞外信號分子激活下游的一個Cdc42交換因子Intersectin，進(jìn)而將Cdc42活化，同時活化一個接頭蛋白N-WASP?；罨腃dc42和N-WASP共同作用于肌動蛋白相關(guān)蛋白(Arp2/3)，從而激活A(yù)rp2/3介導(dǎo)的肌動蛋白聚合反應(yīng)，引起細(xì)胞骨架的變化，產(chǎn)生偽足〔4〕。

慢性腦缺血后，腦組織產(chǎn)生一系列的損傷級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元進(jìn)行性減少，組織學(xué)改變進(jìn)行性加重〔5〕。而海馬是維持正常認(rèn)知功能的重要環(huán)節(jié)。本實驗中水迷宮結(jié)果顯示缺血組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能較假手術(shù)組明顯降低。同時我們觀察到海馬中Cdc42表達(dá)量隨缺血時間延長減少;而實驗證明Cdc42可通過顯著的促進(jìn)肌動蛋白的形成從而促進(jìn)神經(jīng)元的存活并促其再生〔6〕。提示有可能Cdc42促進(jìn)肌球蛋白聚合以及肌動蛋白形成的能力隨表達(dá)量減少而減弱，維持細(xì)胞骨架正常形態(tài)的能力受損，導(dǎo)致海馬區(qū)的神經(jīng)元的存活能力及功能下降，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的形成及加重。

Cdc42信號途徑還可以通過細(xì)胞骨架的重構(gòu)促進(jìn)神經(jīng)元突起的形成、軸突樹突的生長和再生，調(diào)節(jié)樹突棘的密度、生長及維持，進(jìn)而影響神經(jīng)元的形態(tài)以及運(yùn)動功能〔7〕。樹突棘作為突觸可塑性的重要組成部分顯著影響神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)、記憶、發(fā)育、損傷及修復(fù)等多種功能〔8〕。有研究證明激活狀態(tài)的Cdc42對于促進(jìn)海馬神經(jīng)元樹突棘的生長是極為重要的，負(fù)顯性的Cdc42則減少樹突棘的生長〔9〕。Cdc42表達(dá)量的減少還可以引起樹突棘密度的下降〔10〕。結(jié)合曾有研究表明在AD、VD等多種以慢性腦缺血為共同病理過程的疾病中均存在著樹突棘形態(tài)、數(shù)目、結(jié)構(gòu)等的異?！?1〕。支持本實驗中Cdc42表達(dá)減少，可能通過降低樹突棘密度、抑制樹突棘生長而對缺血大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力產(chǎn)生影響。

綜上所述，通過對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能以及海馬區(qū)Cdc42表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)隨缺血時間延長，大鼠認(rèn)知功能障礙逐漸加重，Cdc42表達(dá)量逐漸減少，推測Cdc42可能通過影響細(xì)胞骨架重構(gòu)，引起海馬神經(jīng)元以及樹突棘的存活及功能受損，從而在慢性腦缺血所致認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮重要作用，調(diào)控Cdc42的表達(dá)可能作為慢性腦缺血的新的研究以及治療靶點。

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