體外轉(zhuǎn)染Klotho基因?qū)9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注的影響

李寶善 馬厚勛 王艷嬌 吳 平 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶 400016)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指缺血的心肌在成功恢復(fù)心臟血供的同時(shí)，血液循環(huán)中白細(xì)胞附壁、聚積，滲出血管而浸潤心肌，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，加之補(bǔ)體激活以及活性氧的產(chǎn)生，致使心肌損傷更為嚴(yán)重，出現(xiàn)心肌舒縮功能降低、再灌注心律失常、梗死面積擴(kuò)大等現(xiàn)象。隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、冠脈內(nèi)支架置入術(shù)等新療法的廣泛應(yīng)用，MIRI越來越常見，并在缺血性心臟病病程中扮演了重要的角色，被認(rèn)為是心肌保護(hù)問題的關(guān)鍵〔1〕。為此我們利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將Klotho基因轉(zhuǎn)染至H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞，探討轉(zhuǎn)染Klotho基因?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞MIRI的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒載體pAAV-MCS為Stratagene公司產(chǎn)品。RNAiso Plus、各種限制性內(nèi)切酶、PrimeScript?RT reagent Kit、Premix Taq?Version2.0(Loading dye mix)、DNA Marker、T4 DNA連接酶為TakaRa公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。DMEM高糖培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。Fermentas轉(zhuǎn)染試劑為美國MBI公司產(chǎn)品。H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。胎牛血清購自Hyclone公司。兔抗人、鼠Klotho抗體購自Abcam公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG為博奧森公司產(chǎn)品。LDH與MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。昆明小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。免疫染色固定液、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、抗淬滅封片液均為碧云天公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Nano Drop2000微量分光光度計(jì)(Thermo)，s1000 PCR儀、DNA電泳凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，Leica DM6000B熒光顯微鏡，HEPA Class100 3131型三氣恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，SpectraMax M2e酶標(biāo)儀(Molecular Devices)。

1.2 重組pAAV/Klotho質(zhì)粒構(gòu)建 參考趙景宏等〔2〕研究方法改進(jìn)。

1.4 重組pAAV/Klotho質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定片段大小，膠回收3 kb左右條帶。EcoR I/Xho I分別對(duì)腺相關(guān)病毒空載體pAAV-MCS進(jìn)行雙酶切，膠回收目的片段，然后將酶切后載體與之前酶切回收cDNA片段按1∶10(摩爾數(shù)比)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.5 重組pAAV/Klotho質(zhì)粒的篩選與鑒定 經(jīng)含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，通過EcoR I/Xho I酶切對(duì)陽性重組質(zhì)粒pAAV/Klotho進(jìn)行鑒定。最終將鑒定陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中所報(bào)道目的基因序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

1.6 H9c2(2-1)細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，25 cm2羅口培養(yǎng)瓶，5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.7 H9c2(2-1)細(xì)胞缺血再灌注模型復(fù)制 用以高純N2飽和、缺氧(1%O2)、無糖、缺鈣的 D-hank液模擬缺血溶液，待H9c2(2-1)細(xì)胞生長至鋪滿80%時(shí)置換正常培養(yǎng)液，放人缺氧培養(yǎng)箱中4 h模擬缺血，再以含20%血清的正常培養(yǎng)液置換缺血溶液，開放培養(yǎng)于正常培養(yǎng)箱中12 h模擬再灌注〔3〕。

1.8 基因轉(zhuǎn)染 參照Fermentas轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行。

1.9 實(shí)驗(yàn)分組 A.對(duì)照組(Control)：不轉(zhuǎn)基因，常氧培養(yǎng)64 h;B.模擬I/R組(I/R組)：不轉(zhuǎn)基因，常氧培養(yǎng)48 h后模擬I/R;C.轉(zhuǎn)染Klotho基因組(Klotho組)：以Fermentas轉(zhuǎn)染試劑為載體轉(zhuǎn)染Klotho基因，常氧培養(yǎng)48 h后模擬I/R;D.轉(zhuǎn)染空載體組(Vehicle control組)：不轉(zhuǎn)基因，空載體，常氧培養(yǎng)48 h后模擬I/R;每組重復(fù)5次。

1.10 心肌細(xì)胞Klotho mRNA水平檢測(cè) 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按RNAiso Plus說明書提取總RNA，溶于 DEPC處理水。Nano Drop2000微量分光光度計(jì)測(cè)濃度在 0.5 μg/μl以上，A260/A280在1.9左右。按 PrimeScript?RT reagent Kit說明，10 μl體系加1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，用Premix Taq?Version2.0(Loading dye mix)PCR擴(kuò)增，所用上、下游PCR引物序列分別為5'GGGTCACTGGGTCAATCT3'和5'GCAAAGTAGCCACAAAGG3'(NCBI Reference Sequence：NM_013823.2)，PCR產(chǎn)物長度為710 bp。內(nèi)參同前。

1.11 Klotho蛋白表達(dá)檢測(cè)(免疫熒光法)待各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)細(xì)胞爬片，融合60%左右時(shí)固定20 min、PBS洗4遍，封閉60 min，結(jié)合一抗(1∶37.5)4℃過夜。PBS洗 4遍，1∶75二抗37℃孵育1 h，抗淬滅封片液封片，Leica正置熒光顯微鏡觀察并采圖。

1.12 ELISA檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液Klotho蛋白水平 按ELISA試劑盒說明書操作。

1.13 細(xì)胞損傷指標(biāo)的檢測(cè) ①M(fèi)TT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MTT溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，加DMSO，輕搖10 min，測(cè)各孔吸光度值(OD值)。以對(duì)照組OD值均數(shù)為對(duì)比計(jì)算細(xì)胞活性：細(xì)胞活性=各孔OD值/對(duì)照組OD值均數(shù)。②LDH活性檢測(cè)：按試劑盒說明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。③丙二醛(MDA)含量：操作方法參照試劑盒說明書，721紫外分光光度儀檢測(cè)吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 pAAV/Klotho質(zhì)粒構(gòu)建 以昆明小鼠腎臟總RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)克隆Klotho cDNA全長，EcoR I/Xho I雙酶切，連接載體pAAV-MCS。經(jīng)含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，通過EcoR I/Xho I酶切對(duì)陽性重組質(zhì)粒pAAV/Klotho進(jìn)行鑒定。陽性重組質(zhì)粒EcoR I/Xho I雙酶切后可見約4.7 kb載體片段和約3 kb Klotho cDNA片段(見圖1)。將酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中所報(bào)道目的基因序列完全一致。

2.2 RT-PCR檢測(cè)各組Klotho mRNA表達(dá)情況 結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組均有Klotho mRNA表達(dá)，但Klotho轉(zhuǎn)染組Klotho mRNA表達(dá)水平明顯高于其他組，其余各組間無顯著性差異。說明Fermentas轉(zhuǎn)染試劑為載體轉(zhuǎn)染小鼠Klotho cDNA成功，有效使心肌細(xì)胞Klotho mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(如圖2)。

圖1 pAAV/Klotho載體酶切鑒定

2.3 免疫熒光法檢測(cè)各組Klotho蛋白表達(dá)情況 免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示各組細(xì)胞膜及胞漿中 Klotho蛋白表達(dá)，其中Klotho轉(zhuǎn)染組熒光表達(dá)較其他細(xì)胞組多，熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，說明轉(zhuǎn)染成功，結(jié)果滿意。

2.4 各組細(xì)胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測(cè)結(jié)果 I/R后，細(xì)胞活性較正常對(duì)照組低，反映細(xì)胞損傷的指標(biāo)LDH、MDA明顯較正常對(duì)照組高(P＜0.01)。在I/R的三組中，Klotho轉(zhuǎn)染組(C組)其細(xì)胞活性高于I/R對(duì)照組(B組)和空載體轉(zhuǎn)染組(D組);而其反映細(xì)胞損傷的指標(biāo)LDH、MDA明顯低于I/R對(duì)照組(B組)和空載體轉(zhuǎn)染組(D組)(P＜0.01)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到的Klotho蛋白主要為分泌型Klotho蛋白，Klotho轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌型Klotho蛋白含量明顯高于其他三組(P＜0.01)。見表1。

圖2 RT-PCR結(jié)果

圖3 Klotho蛋白免疫熒光圖

表1 各組細(xì)胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測(cè)結(jié)果( s，n=5)

表1 各組細(xì)胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測(cè)結(jié)果( s，n=5)

與A組相比：1)P＜0.01;與B組相比：2)P＜0.01;與D組相比：3)P＜0.01

組別 細(xì)胞活性(%)上清液LDH含量(U/L)上清液MDA含量(nmol/L)上清液Klotho蛋白含量(U/L)A 100±0 83.75±1.70 1.59±0.07 49.70±4.44 B 68.14±7.401) 218.45±2.791) 2.95±0.151) 45.63±0.811)C 81.32±9.931)2)3)122.15±6.461)2)3)0.53±0.081)2)3)76.85±10.881)2)3)D 69.54±9.211) 206.84±21.761) 2.66±0.351) 45.23±1.651)

3 討論

Klotho基因是1997年由Kuro等〔4〕首先從衰老表現(xiàn)的模型小鼠中克隆成功，并以古希臘神話紡織生命之線女神的名字-Klotho來命名。研究發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)缺陷的小鼠會(huì)出現(xiàn)類似人衰老的一系列表型變化，動(dòng)脈硬化和異位鈣化、糖和能量代謝異常生殖器官萎縮、骨質(zhì)疏松、肺氣腫等。Klotho基因全長50 kb，包含5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，在人類Klotgo基因定位于第13號(hào)染色體(13q12)，其可通過選擇性拼接產(chǎn)生兩種蛋白產(chǎn)物(Klotho)：一種為膜型Klotho蛋白，屬于一種單次跨膜蛋白，其全長為1 012個(gè)氨基酸，主要在腎臟的遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞及腦脈絡(luò)叢等表達(dá)，其作為成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblasts growth factor 23，F(xiàn)GF23)專一性復(fù)合受體的主要成分而發(fā)揮其重要生理調(diào)節(jié)作用;另一種為分泌型Klotho蛋白，該類型缺乏跨膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)，全長為549個(gè)氨基酸，在小鼠血液、尿液及腦脊液中均能被檢測(cè)到。

跨模型Klotho蛋白通過與Na+-K+ATP酶α1亞基結(jié)合，增加該亞基在細(xì)胞表面數(shù)量來實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞外鈣濃度降低的應(yīng)答反應(yīng)〔5〕，具有調(diào)節(jié)離子通道活性;分泌型Klotho作為一種循環(huán)因子或激素，抑制細(xì)胞內(nèi)胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/IGF-1)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)〔6〕，可抑制胰島素/IGF-1信號(hào)通路;還可以抑制氧化應(yīng)激以及Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔7，8〕，并具有調(diào)節(jié)一氧化氮合成的作用。

本研究結(jié)果證明Klotho蛋白對(duì)H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注具有很好的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Klotho的抗氧化應(yīng)激作用，由此推測(cè)Klotho對(duì)H9C2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注的保護(hù)作用機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激有關(guān)，是否還與Klotho調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜離子通道活性、抑制胰島素/IGF-1信號(hào)通路、抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及一氧化氮合成等作用有關(guān)，還有待證實(shí)。

目前基因治療所用的基因載體主要有病毒和非病毒兩類。非病毒載體脂質(zhì)體具有下列優(yōu)點(diǎn)：①易于制備，使用方便，可攜帶大的DNA片斷;②毒性、免疫原性低;③可防止攜帶DNA被體內(nèi)物質(zhì)降解，可將其特異性傳遞到靶細(xì)胞中;④離體細(xì)胞可以瞬間表達(dá)外源基因〔9～11〕。本實(shí)驗(yàn)中使用的脂質(zhì)體是新一代產(chǎn)品——Fermentas轉(zhuǎn)染試劑，用其轉(zhuǎn)染不受血清的干擾，轉(zhuǎn)染操作更為方便。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該Fermentas轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)的外源基因得到了有效表達(dá)。

總之，通過Fermentas轉(zhuǎn)染試劑可以穩(wěn)定地把Klotho基因轉(zhuǎn)入H9c2(2-1)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Klotho基因則可減輕H9c2(2-1)細(xì)胞模擬I-R損傷，對(duì)H9c2(2-1)細(xì)胞具有保護(hù)作用;同時(shí)本研究為探討Klotho基因?qū)θ毖孕呐K病的治療作用、提高其安全性提供了可行的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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