益氣養(yǎng)血化瘀湯對實驗性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表達的影響

姜元輝，段富津，潘志

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

益氣養(yǎng)血化瘀湯是導(dǎo)師段富津教授在多年臨床實踐中總結(jié)出來的治療冠心病一系列有效方劑之一，該方對氣血兩虛兼血瘀型冠心病有確切的療效。本研究將觀察益氣養(yǎng)血化瘀湯對心肌細胞凋亡與相關(guān)蛋白表達干預(yù)的作用。闡明益氣養(yǎng)血化瘀湯治療心肌缺血的作用機理，為其推廣應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 動物與藥物

健康Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(250±10)g，雌雄各半，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。合格證號為(吉)第2007－0003號。按體質(zhì)量將60只健康實驗用大鼠隨機分為空白對照組(以下簡稱空白組)、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、地奧心血康陽性對照組(以下簡稱對照組)6組。每組10只，飼養(yǎng)1周。

益氣養(yǎng)血化瘀湯(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供);地奧心血康膠囊(批號0810044，100mg/粒，成都地奧制藥公司，用時將膠囊去殼，內(nèi)容物用蒸餾水配制成混懸液);鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射液(批號080402，1mg/2ml，上海禾豐制藥有限公司);烏拉坦(滬Q/HG22－771/68，批號 010205);Bcl－2免疫組化染色試劑盒(產(chǎn)品代號:SA2015)，細胞凋亡檢測試劑盒(產(chǎn)品代號:MK1020)，Bax免疫組化染色試劑盒(產(chǎn)品代號:SA1022)，以上試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1．2 實驗器材

普通光學(xué)顯微鏡(日本，OLYMPUS);攝影顯微鏡(CH)型(日本，OLYMPUS);LKB－V超薄切片機(瑞典)。

1．3 實驗方法

按人與大鼠體表面積換算灌胃給藥，高、中、低劑量組比例為4∶2∶1，劑量分別為高劑量組 (28．58g/kg)，中劑量組(14．29g/kg)，低劑量組(7．145g/kg)，對照組(41．49mg/kg)。大鼠每次灌胃 1．5ml/100g。模型組每天相應(yīng)給以生理鹽水。與造模后開始給藥，每日2次，連續(xù)給藥7天。

按文獻方法進行心肌組織切片制備［1］，心肌細胞凋亡原位標記檢測及計算機圖像分析［2］，免疫組化法檢測 Bcl－2 與 Bax［3］。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12．0統(tǒng)計軟件對上述檢查結(jié)果進行分析處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異具有顯著性差異，P＜0．01為差異具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 心肌細胞凋亡變化

通過TUNEL法檢測了心肌細胞凋亡情況及治療組的干預(yù)作用，實驗結(jié)果顯示，光鏡下正常組大鼠未見明顯陽性反應(yīng)。其他各組凋亡心肌細胞TUNEL陽性標記表現(xiàn)為心肌凋亡陽性細胞的細胞核為深淺不一的棕褐色，細胞輪廓清楚;而正常細胞核呈藍色，心肌細胞輪廓完整。各治療組細胞凋亡指數(shù)與模型組相比，均有極顯著差異(P＜0.01)見表1。

表1 益氣養(yǎng)血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠細胞凋亡指數(shù)的比較(±s，n=10)

表1 益氣養(yǎng)血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠細胞凋亡指數(shù)的比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，▲P ＜0．01;與模型組比較，★P＜0．05，★★P ＜0.01。

AI空白組組別n 10 0．79 ±0．12模型組 10 2．44 ±0．18▲低劑量組 10 2．21 ±0．20★★中劑量組 10 1．73 ±0．16★★高劑量組 10 1．40 ±0．16★★對照組 10 1．50 ±0．18★★

表2 益氣養(yǎng)血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠Bax和Bcl－2蛋白表達灰度值比較(±s，n=10)

表2 益氣養(yǎng)血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠Bax和Bcl－2蛋白表達灰度值比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，▲P ＜0．01;與模型組比較，★P＜0．05，★★P ＜0.01。

BaxBcl－2空白組組別n 10 153．4 ±5．32 190．1 ±8．95模型組 10 172．4±5．48▲ 161．3±6．18▲低劑量組 10 164．3±5．23★★ 168．3±6．34★中劑量組 10 158．7±6．57★★ 169．1±5．88★高劑量組 10 155．3±4．72★★ 182．8±10．26★★對照組 10 155．6±6．57★★ 174．2±6．66★★

2．2 急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡相關(guān)基因Bcl－2、Bax表達水平

由表2可知，治療各組在Bax蛋白表達上與模型組相比，均有極顯著差異(P＜0.01);在Bcl－2蛋白表達上，益氣養(yǎng)血化瘀湯中、低劑量組與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)，而高劑量組與模型組比較，差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

胸痹一病總以氣虛為本，血瘀為標，益氣養(yǎng)心活血湯具氣血雙補之功。使陽生陰長，氣血速生，同時補中寓行，行中有補，使補而不滯，藥力迅速布達周身，全方共奏益氣養(yǎng)血活血之功，使心有所主，神有所安，諸癥自除。

Bcl－2蛋白是一種膜整合蛋白，存在于細胞中的線粒體核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并對抗各種凋亡的刺激而對細胞起保護作用，且主要作用在線粒體。Bcl－2蛋白家族的成員有促進和抑制凋亡的功能。Bcl－2通過與Bax結(jié)合抑制凋亡并促進細胞存活，Bcl－xs通過與Bcl－2的結(jié)合置換Bax，啟動凋亡。這一模式很可能是Bcl－2家族蛋白作用于凋亡過程的基本模式。在缺血缺氧狀態(tài)下，心肌細胞可發(fā)生凋亡。心肌細胞凋亡是缺血心肌損傷的重要機制，可導(dǎo)致心肌重構(gòu)，引發(fā)心律失?；蛐牧λソ撸?］。實驗結(jié)果顯示，心肌缺血模型組大鼠心肌不僅細胞凋亡發(fā)生率極高，且心肌細胞Bax蛋白表達也明顯上調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)，心肌缺血模型組大鼠心肌細胞Bcl－2蛋白表達有所減弱。益氣養(yǎng)血化瘀湯能明顯下調(diào)凋亡刺激基因Bax的蛋白表達，上調(diào)凋亡抑制基因Bcl－2的蛋白表達，通過調(diào)節(jié)缺血心肌Bax、Bcl－2基因的蛋白表達從而抑制和阻斷細胞凋亡的發(fā)生，這也是益氣養(yǎng)心活血湯防治CHD(冠心病)心肌缺血損傷的分子病理機制之一。

［1］ 王大安，藺志華．血府逐瘀湯干預(yù)急性心肌缺血心肌細胞凋亡與Bcl－2、Bax表達的實驗研究［J］．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7(1):44－45．

［2］ 王大安，李建文．丹參飲干預(yù)急性心肌缺血心肌細胞凋亡與Bcl－2、Bax表達的實驗研究［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(7):1513－1514．

［3］ 潘志．冠心康抗大鼠急性心肌缺血及對p53和Bcl－2的干預(yù)研究［D］．哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2005．

［4］ 王學(xué)穎，王階，楊戈．心梗后的心肌細胞凋亡與中醫(yī)藥干預(yù)研究進展［J］．中醫(yī)藥學(xué)報，2010，38(2):57－59．