毛脈酸模無(wú)菌苗的制備及下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的研究

謝彥梅，許巖，常豐華，沈劍，王振月

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

毛脈酸模(Rumex gmelini Turcz．)為蓼科酸模屬植物，民間以根及根莖入藥，以治療淋病、癬病、瘡毒、止血、腫瘤和調(diào)血脂等著稱［1］。其根中富含白藜蘆醇及白藜蘆醇苷、酸模素、大黃酚、大黃素等化合物［2－5］。利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有保護(hù)植物資源、生產(chǎn)周期短、不受地區(qū)和季節(jié)限制、利于生物轉(zhuǎn)化，尋找新的有效藥物成分等優(yōu)點(diǎn)［6］。但毛脈酸模組織培養(yǎng)時(shí)，盆栽的毛脈酸模幼苗發(fā)芽率低、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、幼苗較嫩，進(jìn)行外植體消毒時(shí)易于脫水，失去活力不利于誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽等。從無(wú)菌苗得到的外植體不需消毒，外植體活力較高，所以筆者研究毛脈酸模無(wú)菌苗的制備，并比較了不同激素種類或組合對(duì)毛脈酸模下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響，旨在為今后的組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

毛脈酸模種子采自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園。表面消毒劑選用75%的酒精、0．1%的HgCl2溶液和NaClO溶液。NaClO溶液原液(有效氯≥10．0%)購(gòu)自天津市進(jìn)豐化工有限公司。

2 方法

2．1 摩擦種皮對(duì)種子發(fā)芽的影響

挑選粒大飽滿的種子，用120目砂紙摩擦去掉種皮，蒸餾水浸泡24h，第1次消毒時(shí)種子在75%的酒精中浸2min，再將其用10%NaClO溶液處理10min，放置在帶有兩層濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中10h，再進(jìn)行第2次消毒，用10%NaClO溶液處理8min，無(wú)菌水沖洗5次后，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，接種于培養(yǎng)基(MS+3%蔗糖+0．9%瓊脂)中，每皿接種種子20粒，置于光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照14h/d，光照強(qiáng)度1500～2000Lx。觀察初始發(fā)芽時(shí)間，每2天調(diào)查1次材料污染情況，培養(yǎng)10天后統(tǒng)計(jì)污染率和發(fā)芽率。以不去種皮的種子為對(duì)照。

2．2 不同浸泡時(shí)間和消毒次數(shù)對(duì)種子消毒效果的影響

挑選粒大飽滿的種子，120目砂紙摩擦去掉種皮，分別用蒸餾水浸泡0、12h、24h、36h后進(jìn)行消毒。第一次消毒后每組分別取出一半的種子培養(yǎng)，另一半進(jìn)行第2次消毒。具體消毒、培養(yǎng)和統(tǒng)計(jì)方法如2．1。

2．3 消毒劑種類與消毒時(shí)間對(duì)種子消毒效果的影響

挑選粒大飽滿的種子摩擦去皮浸泡24h，將其用75%的酒精浸泡2min后分成四組，分別用10%NaClO溶液處理 10min、15min;0．1%的 HgCl2溶液處理5min、7min。消毒后分別放置在帶有兩層濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中10h，進(jìn)行第2次消毒，每組較第1次的消毒時(shí)間減2min。具體消毒、培養(yǎng)和統(tǒng)計(jì)方法如2．1。

2．4 貯存時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽的影響

將新種子和貯存一年、兩年的種子按2．1的方法消毒、培養(yǎng)和統(tǒng)計(jì)。

2．5 下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織

用接種刀將無(wú)菌苗的下胚軸切割，接種到不同激素濃度的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)30天觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織的生長(zhǎng)狀況。

3 結(jié)果與分析

3．1 摩擦種皮

種子經(jīng)砂紙摩擦、浸泡、消毒、培養(yǎng)一段時(shí)間后的結(jié)果如表1所示，種子發(fā)芽時(shí)間、污染率和發(fā)芽率都與未處理的種子差異明顯。摩擦處理的種子1天就開(kāi)始發(fā)芽，無(wú)污染，發(fā)芽率達(dá)到了81．8%。種皮障礙是毛脈酸模種子發(fā)芽率低的主要原因之一。毛脈酸模種子種皮堅(jiān)硬，硬實(shí)種子可采用多種方法損傷種皮，以達(dá)到促進(jìn)萌發(fā)的目的，如溫度處理、切除種皮、碾磨擦傷種皮、濃硫酸腐蝕種皮、有機(jī)溶劑浸漬去除種皮上的脂類物質(zhì)等［7］。本實(shí)驗(yàn)采用摩擦種皮的方法使發(fā)芽率得到顯著提高。

表1 摩擦種皮對(duì)種子發(fā)芽的影響

3．2 浸泡時(shí)間和消毒次數(shù)對(duì)消毒效果的影響

浸泡時(shí)間和消毒次數(shù)對(duì)消毒效果的影響如表2所示。通過(guò)不同浸泡時(shí)間和消毒次數(shù)對(duì)種子處理后，觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)兩次消毒的種子與一次消毒的種子相比污染率明顯降低，初始發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽率沒(méi)有明顯差異，控制污染是組培過(guò)程中的首要技術(shù)［8］，所以選擇兩次消毒是比較合理的。浸泡24h的種子發(fā)芽率明顯高于未浸泡和浸泡12h、36h的種子，說(shuō)明種子浸泡24h是適合萌發(fā)的最佳條件。

表2 浸泡時(shí)間和消毒次數(shù)對(duì)消毒效果的影響

3．3 最佳消毒劑和消毒時(shí)間的選擇

表3所示，10%NaClO溶液作為毛脈酸模種子的消毒劑時(shí)消毒效果最好，其成苗率優(yōu)于0．1%HgCl2溶液消毒法。10%NaClO溶液浸種10min與15min消毒效果相比較，消毒10min的種子開(kāi)始發(fā)芽時(shí)間短，發(fā)芽率相對(duì)較高，效果明顯。

表3 不同消毒劑和消毒時(shí)間效果比較

3．4 種子貯存時(shí)間對(duì)發(fā)芽的影響

分別取不同貯存時(shí)間的種子研究對(duì)比，結(jié)果如表4，種子貯存時(shí)間越長(zhǎng)，開(kāi)始萌發(fā)時(shí)間越晚，發(fā)芽率越低?？赡苁且?yàn)榉N子隨著貯存時(shí)間的增長(zhǎng)，活力開(kāi)始下降。說(shuō)明組織培養(yǎng)最好用當(dāng)年新采收的種子。

表4 貯存時(shí)間對(duì)發(fā)芽的影響

3．5 不同濃度激素組合對(duì)毛脈酸模愈傷組織發(fā)生的影響 見(jiàn)表5。

表56－BA和2，4－D配比對(duì)下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

觀察表明，下胚軸接種10天后，有的培養(yǎng)基上開(kāi)始形成愈傷組織。由表5可見(jiàn)，當(dāng)激素6－BA濃度不變時(shí)，激素2，4－D濃度在1．5～3 mg/L范圍內(nèi)，愈傷組織誘導(dǎo)率較高。觀察統(tǒng)計(jì)表明，6－BA濃度為3．0mg/L、2，4－D 濃度為 1．7mg/L配合使用時(shí)，不僅愈傷組織的誘導(dǎo)率為100%，而且愈傷組織的生長(zhǎng)速度快，長(zhǎng)勢(shì)好。初期誘導(dǎo)形成的愈傷組織為半透明淡黃色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，伴隨著愈傷組織的生長(zhǎng)，逐漸形成顆粒狀、質(zhì)地疏松的愈傷組織。一般認(rèn)為，這種愈傷組織為具有分化能力的愈傷組織［9－10］。綜合考慮，MS+3．0mg/L 6－BA+1．7mg/L 2，4－D 的激素組合是下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成的愈傷組織可以為未來(lái)愈傷組織形成再生植株和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)提供大量的材料。

4 小結(jié)與討論

筆者系統(tǒng)研究了建立毛脈酸模無(wú)菌苗培養(yǎng)體系的最佳方法、下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。獲得毛脈酸模無(wú)菌苗的方法是:挑選粒大飽滿的新種子，120目砂紙摩擦種皮，蒸餾水浸泡24h，在75%酒精中浸2min，無(wú)菌水沖洗3次，再將其用10%NaClO溶液處理10min，無(wú)菌水沖洗5次，將其放置在有兩層濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中10h，再進(jìn)行第二次消毒，用10%NaClO溶液處理8min，無(wú)菌水沖洗5次，再將其在無(wú)激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可獲得大量無(wú)菌苗;下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+3．0mg/L 6－BA+1．7mg/L 2，4－D。消毒是植物組織培養(yǎng)中無(wú)菌苗培養(yǎng)的首要工作，而NaClO、HgCl2是常用的兩種消毒劑，本實(shí)驗(yàn)0．1%HgCl2溶液處理后的無(wú)菌苗雖然無(wú)污染，但發(fā)芽時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)芽率低，可能0．1%HgCl2對(duì)毛脈酸模種子有較強(qiáng)的毒害作用，從而抑制其萌發(fā)［11］。汞脅迫對(duì)毛脈酸模種子生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，查閱文獻(xiàn)［12］發(fā)現(xiàn)，其機(jī)理可能是重金屬元素Hg對(duì)植物體內(nèi)酶活性有影響，根據(jù)這一現(xiàn)象推測(cè)毛脈酸模可能作為汞脅迫的指示植物。從無(wú)菌苗上獲得的組織器官作為外植體進(jìn)行愈傷組織、叢生芽誘導(dǎo)時(shí)無(wú)需消毒，活力高。從筆者前期實(shí)驗(yàn)研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)率明顯提高，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)好，可以為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)提供大量的材料，為今后內(nèi)生真菌與細(xì)胞或者組培苗相互作用，可能產(chǎn)生有效藥物成分奠定基礎(chǔ)。

［1］ 吉林省中醫(yī)中藥研究所．長(zhǎng)白山植物藥志［M］．長(zhǎng)春:吉林人民出版，1982:299．

［2］ 王振月，李延冰，匡海學(xué)，等．毛脈酸模中大黃酚、大黃素的分離鑒定［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1996，24(2):54．

［3］ 王振月，蔡學(xué)勤，康毅華，等．毛脈酸模中兩個(gè)化合物結(jié)構(gòu)研究［J］．中草藥，1996，27(12):714．

［4］ 王振月，左月明，康毅華，等．毛脈酸模的化學(xué)成分的研究(Ⅱ)［J］．中草藥，2005，36(11):1626－1627．

［5］ 門(mén)敬菊，王振月，王宗權(quán)．植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)毛脈酸模根中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的影響［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(5):60－62．

［6］ 徐忠東．植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥物研究進(jìn)展［J］．生物學(xué)雜志，2001，18(6):13－14．

［7］ 顏啟傳 ．種子學(xué)［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001:73－78．

［8］ 潘娟，李先源，李名揚(yáng)．植物組織培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(6):2392－2394．

［9］ 安利佳，姜長(zhǎng)陽(yáng)．植物組織培養(yǎng)導(dǎo)論［M］．大連:遼寧師范大學(xué)出版社，1996:68－72．

［10］ 胡尚連，王丹．植物生物技術(shù)［M］．西安:西安交通大學(xué)出版社，2004:35－40．

［11］ 吳志剛．番茄組織培養(yǎng)中無(wú)菌苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(4):335－337．

［12］ 徐小蓉，周敏，時(shí)艷龍，等．汞脅迫對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(2):420－422．