大鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中EphA2、EphrinA1 和E-cadherin的表達(dá)

劉進(jìn)忠，張 沛

鄭州大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔病理科 鄭州450052

△男，1967年12月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:口腔癌的早期診斷，E-mail:Liujz@zzu.edu.cn

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)為世界五大常見腫瘤之一［1］，在口腔頜面部惡性腫瘤中最為常見，占口腔頜面部惡性腫瘤的80%以上［2］。隨著治療水平的不斷提高，OSCC 的預(yù)后已有了極大的改善，但OSCC 的早期診斷及遠(yuǎn)期療效仍不理想，預(yù)后較差，5 a 生存率僅50%左右［3-4］。作者應(yīng)用免疫組化SP 法檢測(cè)大鼠正?？谇火つさ絆SCC 發(fā)生及演變組織中EphA2、EphrinA1和E-cadherin 的表達(dá)，為OSCC 的癌前診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 EphA2、E-cadherin 兔抗大鼠多克隆抗體購自北京博奧森生物制劑公司，EphrinAl 兔抗大鼠多克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz 生物技術(shù)公司，DAB 試劑盒和SP-9001 生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。70只雄性Wistar 大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠為8 周齡，體質(zhì)量約為200 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 取7 只作為正常對(duì)照(不處理)，余63 只為實(shí)驗(yàn)組，在口腔腭黏膜涂抹5 g/L 4NQO蒸餾水溶液，2 d 1 次，連續(xù)28 周。分別于處理4、8、12、16、20、24 和28 周隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組9 只和對(duì)照組大鼠1 只，實(shí)驗(yàn)組取大鼠上腭部分病變黏膜組織(對(duì)照組取大致相同部位)，石蠟包埋。顯微鏡下觀察，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生協(xié)助做出病理學(xué)診斷和分級(jí)。大鼠上腭組織病理改變大致分為:7例正常黏膜，14例上皮單純性增生黏膜，6例上皮輕度異常增生黏膜，10例上皮中度異常增生黏膜，19例上皮重度異常增生黏膜，14例鱗狀細(xì)胞癌組織黏膜。

1.3 EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白的免疫組化檢測(cè) 所有標(biāo)本4 μm 厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水; 檸檬酸抗原修復(fù); 體積分?jǐn)?shù)3%H2O2去離子水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，在37℃溫箱中孵育20 min; 滴加山羊血清50 μL/片，室溫封閉內(nèi)源性生物素20 min; 滴加適當(dāng)比例的一抗(EphA2 和EphrinA1 按1 ∶ 100 稀 釋，E-cadherin 按1∶ 200稀釋)，37℃孵育3 h; 滴加二抗，50 μL/片，37℃孵育30 min; 滴加辣根酶標(biāo)記卵霉鏈白素，50 μL/片，37℃孵育30 min; DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.4 免疫組化結(jié)果判定 EphA2 和EphrinA1 陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈散在或密集的棕黃色顆粒; E-cadherin 陽性染色定位于胞質(zhì)或細(xì)胞核，以胞質(zhì)染色為主，呈散在或密集的棕黃色顆粒。運(yùn)用Biosens Digital Imaging System v1.6 圖像分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)判斷結(jié)果:在光學(xué)顯微鏡下每張切片選5 個(gè)視野(×100)，在同一光強(qiáng)度下測(cè)量陽性信號(hào)的平均光密度作為蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)。不同大鼠口腔黏膜組織中EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析運(yùn)用Pearson 相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠不同病理類型口腔黏膜組織中EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白的表達(dá) EphA2 與EphrinA1 主要表達(dá)在口腔癌細(xì)胞和異常增生細(xì)胞中，在正?？谇火つぜ?xì)胞中不表達(dá)或微表達(dá)。Ecadherin 主要表達(dá)在正?？谇火つぜ?xì)胞，在口腔癌細(xì)胞中不表達(dá)或微表達(dá)。見圖1、表1。

圖1 大鼠不同病理類型口腔黏膜組織中EphA2(A)、EphrinA1(B)和E-cadherin(C)蛋白的表達(dá)(SP，×100)

表1 大鼠不同病理類型口腔黏膜組織中EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白的表達(dá)

2.2 OSCC組織中EphA2、EphrinA1 與E-cadherin 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 OSCC組織中EphA2 與EphrinA1 的表達(dá)呈正相關(guān)(r =0.708，P =0.015)，與E-cadherin 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r = － 0.531，P =0.004)，EphrinA1 與E-cadherin 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= －0.596，P ＜0.001)。

3 討論

酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinase，RTK)作為跨膜傳導(dǎo)某一細(xì)胞外信號(hào)的主要成分，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活以及遷移中起重要作用。Eph 受體是已知RTK 中最大的Ⅰ型跨膜糖蛋白家族成員，Eph 受體與其配體Ephrin 的相互作用可促進(jìn)細(xì)胞間的連接與黏附，從而使它們正常地表達(dá)［5-6］。正常上皮細(xì)胞中，Eph 家族成員中EphA2 與其配體EphrinA1 相結(jié)合，發(fā)生自身磷酸化和降解，因此正常上皮細(xì)胞中EphA2 與其配體EphrinA1 低表達(dá);而在腫瘤細(xì)胞中，由于EphA2 與其配體不能有效地結(jié)合，細(xì)胞間黏附力下降，使其在腫瘤細(xì)胞中堆積，不能降解，出現(xiàn)高表達(dá)［7］。

E-cadherin 是最主要的細(xì)胞間黏附分子，在上皮細(xì)胞中，E-cadherin 與EphA2 協(xié)同定位在細(xì)胞間連接位點(diǎn)，E-cadherin 參與調(diào)控EphA2 及其配體EphrinA1 的結(jié)合及后續(xù)降解，從而間接調(diào)控EphA2 的蛋白表達(dá)和功能轉(zhuǎn)化［8-9］。因此，EphA2 與其配體EphrinA1 在腫瘤中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制可能與E-cadherin 表達(dá)的下降有關(guān)［10］。

該研究結(jié)果顯示，EphA2、EphrinA1 蛋白在正常組織中低表達(dá)，而隨著口腔黏膜組織的惡行性轉(zhuǎn)化，它們的表達(dá)水平也隨之升高，尤其在OSCC組織中的表達(dá)水平最高，與上述研究［7］相符。而E-cadherin蛋白的表達(dá)隨著OSCC 的發(fā)生呈下降趨勢(shì)。

該研究結(jié)果還顯示，OSCC組織中EphA2 與EphrinA1 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，而二者均與E-cadherin 的表達(dá)負(fù)相關(guān)，這驗(yàn)證了E-cadherin 在EphA2與其配體EphrinA1 的結(jié)合與降解中起調(diào)節(jié)作用的理論機(jī)制。EphA2、EphrinA1 與E-cadherin 的表達(dá)具有密切關(guān)聯(lián)性，可考慮將三者聯(lián)合作為口腔癌惡性發(fā)展的監(jiān)控指標(biāo)，為早期診斷與治療提供依據(jù)。

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