圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的分離和規(guī)模制備與保存技術(shù)及應(yīng)用

韓之波 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實驗血液學(xué)國家重點實驗室 天津300020）

圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的分離和規(guī)模制備與保存技術(shù)及應(yīng)用

韓之波 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實驗血液學(xué)國家重點實驗室 天津300020）

間充質(zhì)干細胞（MSC）是來源于中胚層的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。系統(tǒng)地研究了P-MSC與骨髓MSC生物學(xué)特性和功能的異同，建立的圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的分離和規(guī)模制備與保存技術(shù)體系，為推動我國乃至國際干細胞藥物的開發(fā)以及干細胞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的作用。

圍產(chǎn) 間充質(zhì)干細胞 骨髓 生物學(xué)

間充質(zhì)干細胞（MSC）是來源于中胚層的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。MSC能在特定條件下分化為包括神經(jīng)細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞在內(nèi)的多組織系統(tǒng)的細胞。此外，MSC對造血、免疫炎癥反應(yīng)、血管新生等人體重要功能起重要調(diào)節(jié)作用。MSC是繼造血干細胞之后又一類已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛臨床試驗的干細胞，是組織工程的種子細胞。MSC因具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，其技術(shù)產(chǎn)品的開發(fā)已經(jīng)成為全球生物醫(yī)藥領(lǐng)域的競爭熱點。

截止至2012年2月，在美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes ofHealth，NIH）注冊的關(guān)于間充質(zhì)干細胞的臨床研究已經(jīng)超過200項。和其他干細胞相比，間充質(zhì)干細胞因其具有良好的擴增能力、來源廣泛、可避免倫理學(xué)問題等優(yōu)勢，已逐漸成為干細胞治療的重要組成部分。中國是干細胞治療臨床研究比較發(fā)達的國家之一。國內(nèi)的科研機構(gòu)或醫(yī)院在NIH注冊了48項關(guān)于間充質(zhì)干細胞的臨床研究。目前美、英、法、韓、印等國家藥品監(jiān)督管理部門已批準了20多個干細胞制品分別進入I、II、III期臨床研究。2010年5月4日美國FDA授權(quán)人骨髓間充質(zhì)干細胞Prochymal作為孤兒藥用于Ⅰ型糖尿病的臨床治療，韓國2011年7月1日批準了自體骨髓間充質(zhì)干細胞Hearticellgram-AMI上市，用于心梗和心衰治療。2012年1月19日韓國又批準了全球首個的異基因干細胞藥物——臍帶血來源間充質(zhì)干細胞CartiStem上市，用于植入治療關(guān)節(jié)軟骨缺損。

然而，從何種組織、用什么技術(shù)去分離培養(yǎng)出高純度、安全、有效、穩(wěn)定、可規(guī)模化制備、質(zhì)量可控、數(shù)量足夠的MSC，這是干細胞領(lǐng)域的核心技術(shù)。骨髓是以前公認的MSC主要來源，但實際上骨髓中MSC的含量極少，僅占成人骨髓單個核細胞的0.002%～0.005%。近年發(fā)現(xiàn)臍血、臍帶、胎盤、脂肪、肌肉、頭皮、牙周質(zhì)等多種組織中也可分離得到MSC。研究還發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)MSC的數(shù)量隨著年齡的增大而減少，在骨髓細胞中的含量分別是出生時為1/10 000，10歲為1/10萬，30歲為1/25萬，50歲為1/40萬，80歲為1/200萬。由于人體內(nèi)MSC是供人一生中組織修復(fù)和再生所必需的，從倫理學(xué)、醫(yī)學(xué)、細胞工程學(xué)的角度來看，成人體內(nèi)的MSC顯然不適合作為一種可以批量化生產(chǎn)用于常規(guī)治療的MSC來源，新的臨床適用型MSC亟待開發(fā)。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊近十年來一直致力于臨床適用型間充質(zhì)干細胞的鑒別、分離和培養(yǎng)擴增，研究發(fā)現(xiàn)人臍帶、胎盤羊膜和絨毛膜、臍血和羊水等與出生相關(guān)的圍產(chǎn)期組織富含間充質(zhì)干細胞，現(xiàn)國際上統(tǒng)稱為圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞。圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞（Perinatal mesenchymal stem cells，P-MSC）是介于胚胎干細胞和成人干細胞之間的干細胞，其增殖和分化能力比胚胎干細胞低，但明顯高于成人干細胞（見圖1）。同時，韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊系統(tǒng)地研究了P-MSC與骨髓MSC生物學(xué)特性和功能的異同，發(fā)現(xiàn)P-MSC與骨髓MSC有類似特性，但增殖分化能力更強，免疫原性更低，具有很好的造血支持、免疫調(diào)節(jié)以及組織修復(fù)與再生功能，其機制與P-MSC分泌眾多因子和PGE2等有關(guān)。P-MSC不具致瘤性,也無明顯促瘤性,對白血病生長有抑制等作用。由于胎盤臍帶取材方便并富含干細胞，P-MSC的提取和應(yīng)用系變廢為寶且不存在倫理問題，特別易于規(guī)?；苽浜彤a(chǎn)業(yè)化操作。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊以圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)為主線，結(jié)合一些分析干細胞特性和基因穩(wěn)定性的新技術(shù)、種子干細胞庫技術(shù)、成品庫技術(shù)條件、拉曼光譜散射分析技術(shù)、干細胞活性精確分析技術(shù)等，形成了完整的P-MSC庫技術(shù)流程，包括供者篩選、組織（胎盤、臍帶、臍帶血）采集、P-MSC分離與培養(yǎng)鑒定、種子干細胞檢測保存、終產(chǎn)品規(guī)模制備與檢測、保存和發(fā)放使用的技術(shù)體系。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊組建了世界第一個圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞庫，為公眾提供干細胞存儲服務(wù)，儲存量已突破10 000份。同時提供高純度P-MSC供研究用。干細胞庫工藝流程包括：①干細胞供者的篩查。②臍帶胎盤的無菌采集、運輸、保存，既能保證P-MSC的生物學(xué)活性，又能減少污染。③種子P-MSC庫技術(shù)，P-MSC的分離、規(guī)?；苽浜捅４婕夹g(shù)是P-MSC庫建立的核心技術(shù)。通過對酶的種類、濃度、時間、溫度進行實驗，篩選出最佳組合，顯著提高了細胞的分離效率。通過對凍存保護劑的配方進行優(yōu)化，顯著提高了細胞的活率。用氣相液氮罐保存細胞，大大降低了細胞間交叉污染的可能。④P-MSC的檢測，由于是新技術(shù)，國內(nèi)外缺乏檢測標準。為了確保干細胞的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，科研團隊又建立了MSC庫質(zhì)量標準，其中檢測參數(shù)二十幾項，藥典上沒有的參數(shù)科研團隊都一一建立方法，并完成了工作量巨大的方法驗證工作。此外，在國際上首次建立拉曼散射光譜傳感分析MSC的生物活力技術(shù)，測量不同狀態(tài)下干細胞的特征拉曼光譜，為干細胞生物活力的分析提供了無創(chuàng)性快速檢測技術(shù)。⑤質(zhì)量管理體系：建立了一套完善的質(zhì)量管理體系，對人、機、料、法、環(huán)等各個環(huán)節(jié)進行質(zhì)量管理，實現(xiàn)對供者篩查、組織采集、運輸、加工、檢測鑒定、凍存、放行等全過程的嚴格監(jiān)控，保證細胞庫的正常運行。通過攻關(guān)，研究團隊在國際上首次制定出《臍帶間充質(zhì)干細胞庫公共庫技術(shù)條件》、《臍帶間充質(zhì)干細胞庫自體儲存技術(shù)條件》和《臍帶間充質(zhì)干細胞制品技術(shù)條件》3種技術(shù)標準，獲政府頒發(fā)的產(chǎn)品執(zhí)行標準證書，通過ISO 9001國際認證。這些標準規(guī)范了干細胞的研究和產(chǎn)品制備，推動了我國干細胞產(chǎn)業(yè)標準化進程，制定的企業(yè)標準為國家行業(yè)標準的制定提供了依據(jù)。⑥一類新藥——注射用臍帶間充質(zhì)干細胞的臨床前安全性的評價，包括對體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的P-MSC選取不同代次進行傳代穩(wěn)定性的研究，以觀察傳代過程是否會發(fā)生細胞的突變。檢測參數(shù)包括：染色體核型、癌基因、端粒酶、細胞表型、分化能力。結(jié)果表明，P-MSC經(jīng)過傳代后不會發(fā)生細胞惡性轉(zhuǎn)化，傳代過程安全穩(wěn)定。同時，在注射用臍帶間充質(zhì)干細胞的臨床前安全性評價中開展了全方面的實驗，包括：急性毒性試驗、長期毒性試驗、全身過敏反應(yīng)、溶血性試驗、致瘤試驗、對腫瘤生長的影響試驗。

另外，韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊對注射用臍帶間充質(zhì)干細胞的制備工藝進行了嚴格的規(guī)范，對原料、中間品、成品都采取了嚴格的質(zhì)量控制措施，制定了《注射用間充質(zhì)干細胞（臍帶）制造和檢定規(guī)程》，規(guī)定了供者原代傳代細胞庫質(zhì)量標準、成品質(zhì)量標準。根據(jù)質(zhì)量標準，篩選出供者細胞作為安全種子的來源，對每批成品進行質(zhì)量檢驗，全部項目合格方可入庫供臨床使用，以此保證臨床供應(yīng)細胞的安全性。該質(zhì)量標準已經(jīng)過中檢所專家審核，同時按該規(guī)程制備的樣品經(jīng)中檢所復(fù)核檢驗全部合格。

采用自主創(chuàng)新技術(shù)形成的產(chǎn)品也產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟效益，從2007年起投入市場到2011年12月底，累計收入達1.05億萬元人民幣。同時，該技術(shù)體系的建立也受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。2009年3月3日，韓忠朝應(yīng)邀在法蘭西國家醫(yī)學(xué)科學(xué)院（Academie Nationale de Medecine）院士會議上報告了圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的臨床前和臨床實驗性治療的成功結(jié)果，引起該院的高度重視。會后法蘭西國家醫(yī)學(xué)科學(xué)院專門成立了5個院士工作小組，調(diào)查分析圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的科學(xué)優(yōu)勢、潛在風(fēng)險和倫理法律相關(guān)問題，提出干細胞治療的建議，并在法蘭西國家醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊上發(fā)表研究報告。隨著研究的深入，法蘭西國家醫(yī)學(xué)科學(xué)院于2011年12月13日再次邀請韓忠朝于2012年1月在該院作一個《自體和異基因圍產(chǎn)期干細胞的應(yīng)用》的學(xué)術(shù)報告，獲得院士們的高度評價。

韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊建立的圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的分離和規(guī)模制備與保存技術(shù)體系，為推動我國乃至國際干細胞藥物的開發(fā)以及干細胞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到積極的作用。截至2011年11月22日，美國NIH的臨床試驗網(wǎng)站（www.clinicaltrials.gov）已登記的P-MSC臨床試驗已經(jīng)達58項（33項臍帶MSC，22項臍血MSC，3項胎盤MSC）。自從2007年韓忠朝教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊組建了世界第一個圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞庫以來，目前國際和國內(nèi)已經(jīng)有多家干細胞庫開展了圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞的技術(shù)服務(wù)，還有多個圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞相關(guān)的細胞治療藥物正在進行臨床前或臨床研究。國內(nèi)單位在國內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細胞相關(guān)的臨床試驗結(jié)果論文有31篇，接受實驗性治療的患者近400例，涉及GVHD、自身免疫疾病、再障、心臟病、腦血管病、肝硬化、糖尿病等，結(jié)果顯示出其具有良好的應(yīng)用前景，為許多難治性疾病提供了新的治療方案?！?/p>

2012-03-06