成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)的安全性研究進(jìn)展

張 文 李愛斌

一直以來，干細(xì)胞都是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，隨著對(duì)干細(xì)胞特性的逐步認(rèn)識(shí)，干細(xì)胞技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，在再生醫(yī)學(xué)與組織工程等方面具有不可替代的應(yīng)用前景。但是，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤的發(fā)生與干細(xì)胞有著一定的關(guān)系，腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞之間存在著一定的相似性。有多數(shù)學(xué)者提出了腫瘤源于干細(xì)胞的假說，近幾年也有腫瘤干細(xì)胞這一說法?，F(xiàn)在，已有研究表明干細(xì)胞在體外培養(yǎng)一定時(shí)間，即可發(fā)生突變。所以，干細(xì)胞的安全性已引起人們的高度重視。

一、干細(xì)胞

干細(xì)胞(stem cells，SC)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的原始細(xì)胞，處于未定向分化狀態(tài)，同時(shí)具有增殖的能力。在一定條件下，可以分化成具有特異分子標(biāo)志、特征性形態(tài)和特殊功能的成熟細(xì)胞。干細(xì)胞具有自我更新的能力是由于通過不對(duì)稱分裂的子代細(xì)胞維持了干細(xì)胞的潛能。根據(jù)干細(xì)胞發(fā)生學(xué)來源可以將其分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)和成體干細(xì)胞(somatic stem cell)兩種。胚胎干細(xì)胞屬于全能干細(xì)胞，發(fā)育等級(jí)較高，來源于胎盤和胎兒組織，是由受精卵發(fā)育而來的具有全能性的干細(xì)胞，分化潛能較廣［1］。成體干細(xì)胞，來源于成體器官或者成年個(gè)體組織，是存在已分化組織中的未分化細(xì)胞［1］。雖然成體干細(xì)胞的增殖能力有限，但是依然具有較強(qiáng)的自我更新和分化潛能，可以分化為某種或某幾種功能的體細(xì)胞，同時(shí)具有可塑性，可以打破胚層界限從而橫向分化為無關(guān)類型的成熟細(xì)胞或者在特定的環(huán)境下發(fā)生逆分化［2］。

二、腫瘤干細(xì)胞

隨著對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展研究的深入，有多數(shù)學(xué)者提出了腫瘤干細(xì)胞學(xué)說，認(rèn)為腫瘤生長，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是依靠腫瘤細(xì)胞中一定數(shù)量的具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群。1994年，人急性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞首次得到證實(shí)，之后又在乳腺癌瘤體中分離出腫瘤干細(xì)胞。2006年，腫瘤干細(xì)胞的定義于美國癌癥研究協(xié)會(huì)召開的腫瘤干細(xì)胞研討會(huì)上提出，即在腫瘤組織中具有自我更新能力，同時(shí)可以產(chǎn)生一系列異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞［3］。之后，腫瘤干細(xì)胞受到多領(lǐng)域的關(guān)切，陸續(xù)有研究證實(shí)，在不同的腫瘤組織中均存在腫瘤干細(xì)胞，比如腦部、皮膚、白血病、乳房、結(jié)腸、頭頸部、腎臟、肝臟、前列腺、和胰腺腫瘤，并且證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞在耐藥，腫瘤復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移中起了主要作用［4～11］。

腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的致瘤能力，也就是說腫瘤干細(xì)胞可以不斷自我更新，并形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞，但是腫瘤細(xì)胞會(huì)喪失不斷增殖的能力，最終死亡，所以說腫瘤干細(xì)胞在啟動(dòng)腫瘤形成、生長中起決定性作用［12］。

三、腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞的關(guān)系

目前，關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的起源有不同的觀點(diǎn)，一種認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞源自正常干細(xì)胞，另一種認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是正常體細(xì)胞突變而來?，F(xiàn)在，越來越多的研究結(jié)果支持第一種觀點(diǎn):即腫瘤干細(xì)胞很可能是由正常干細(xì)胞在長期的自我更新過程中，發(fā)生了基因突變，使部分調(diào)控干細(xì)胞增殖分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號(hào)蛋白發(fā)生了變化，被不正常的信號(hào)誘導(dǎo)為腫瘤干細(xì)胞。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟的基因變化效應(yīng)，是經(jīng)歷了多階段后產(chǎn)生的，正常體細(xì)胞突變形成腫瘤需要復(fù)雜而漫長的過程，而成熟細(xì)胞半衰期短，所以，體細(xì)胞突變形成腫瘤的可能性小。而正常干細(xì)胞是唯一能夠自我更新的細(xì)胞，壽命長，更有可能積累足夠的突變基因，轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞。

腫瘤有可能源自干細(xì)胞增殖過程的任何階段受到阻斷，所以腫瘤分化程度與其相應(yīng)起源的干細(xì)胞分化階段相關(guān)。如果阻斷發(fā)生在干細(xì)胞分化階段的早期，則腫瘤細(xì)胞就表現(xiàn)為低分化;如果阻斷發(fā)生在后期，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為高分化。與之相應(yīng)的是臨床上的良性腫瘤和惡性腫瘤之分。

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞具有一些相似點(diǎn)，兩者都具有自我增殖和更新的能力，不過干細(xì)胞的增殖具有自穩(wěn)定性，在增殖過程中，總數(shù)目保持恒定，而腫瘤干細(xì)胞僅僅表現(xiàn)出無限增殖的能力，并無自穩(wěn)定性。干細(xì)胞具有遷移性，可遷移到特定的組織或者器官，與腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相似。再者，腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞的生長調(diào)控機(jī)制具有相似性，一些研究表明干細(xì)胞生長發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路相似，例如Bmi－1、Notch、Wnt、SHH等［13～15］。

干細(xì)胞在體內(nèi)主要起到修復(fù)損傷組織的作用，組織受損即激活體內(nèi)Hedgehog和Wnt信號(hào)途徑，使干細(xì)胞增殖分化，修復(fù)損傷的組織。如果機(jī)體處于長期受損狀態(tài)，Hedgehog和Wnt信號(hào)途徑就會(huì)一直被激活，這些信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞癌變方面也起到一定的作用，這時(shí)在環(huán)境或者致癌因子等不利因素的影響下，會(huì)導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)途徑中某些分子發(fā)生突變，引起干細(xì)胞過度增殖，形成腫瘤。有研究證實(shí)，如果間充質(zhì)干細(xì)胞或者骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化途徑被阻斷，就會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)楣侨饬觯?6］。

四、體外培養(yǎng)對(duì)干細(xì)胞的影響

干細(xì)胞在臨床的治療和應(yīng)用前景已經(jīng)明確，但是，由于人體內(nèi)干細(xì)胞的數(shù)量有限，所以必需在體外大規(guī)模擴(kuò)增干細(xì)胞。我們知道，任何生物體都有適應(yīng)其生存的微環(huán)境，稱之為壁龕(niche)，干細(xì)胞的壁龕包括基膜成分、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、間質(zhì)細(xì)胞以及成體干細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子等成分組成，壁龕的成分與結(jié)構(gòu)特殊性是維持不同譜系干細(xì)胞處于相對(duì)未分化狀態(tài)的關(guān)鍵。所以，當(dāng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，由于處于相對(duì)開放的環(huán)境中，并且接觸到一些血清、細(xì)胞因子、酶等一些化學(xué)和生物制劑，失去了原本適合其生存的壁龕，再加上干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的一些生物學(xué)特性極為相似，所以一些研究者就對(duì)長期體外培養(yǎng)的干細(xì)胞的生物學(xué)性狀以及安全性進(jìn)行研究。

有研究者對(duì)豬骨的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)傳至40代以后，干細(xì)胞即出現(xiàn)老化的特征，比如說肌動(dòng)蛋白過量積蓄，溶酶體酸牛乳糖苷酶活性增加，基質(zhì)黏附性降低等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在體外培養(yǎng)的晚期干細(xì)胞分化潛能以及分化能力下降，生物學(xué)特性已經(jīng)發(fā)生改變。據(jù)2002年Science報(bào)道，將人類胚胎干細(xì)胞種植帕金森病的小鼠大腦內(nèi)，一些小鼠體內(nèi)的干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元，但是另一些小鼠體內(nèi)的干細(xì)胞分化為畸胎瘤導(dǎo)致小鼠死亡。在長期的體外培養(yǎng)過程中，由于染色體的不穩(wěn)定和錯(cuò)亂基因的堆積，正常的細(xì)胞周期失控，可能發(fā)生錯(cuò)亂的信號(hào)調(diào)控，導(dǎo)致干細(xì)胞發(fā)生突變。有研究報(bào)道，將胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞種植遺傳性退行性病變的患者中，在患者的脊髓和腦組織中發(fā)現(xiàn)了腫塊。Wu等通過向裸鼠皮下注射在體外傳至17代的神經(jīng)源性干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有個(gè)別裸鼠皮下有腫塊生長，取腫塊組織并進(jìn)行原代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)得到的細(xì)胞不僅保持干細(xì)胞的特性、表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白以及CD133，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有異常染色體核型，并且具有快速增殖的特征，將這些細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)并注入裸鼠皮下后發(fā)現(xiàn)，雖然這些細(xì)胞不具有皮下致瘤性，但是卻導(dǎo)致顱內(nèi)腫瘤的發(fā)生。如何確保既能獲得充足數(shù)量的干細(xì)胞又能避免干細(xì)胞突變需要更進(jìn)一步的研究。

五、干細(xì)胞安全性的主要檢測(cè)方法

干細(xì)胞移種植人體后，在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程更加不易控制，所以，需要對(duì)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格的生物特性及安全性檢測(cè)，確保人體移植的安全性。目前，干細(xì)胞安全性的主要檢測(cè)指標(biāo)大概包括以下幾種:①形態(tài)學(xué)觀察:應(yīng)用倒置顯微鏡和透射電鏡對(duì)干細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察;②細(xì)胞生長周期的檢測(cè);③干細(xì)胞核型分析，采用G顯帶方法觀察染色體是否有缺失，易位和倒位、融合等異常變化;④裸鼠皮下致瘤性，觀察裸鼠皮下干細(xì)胞注射部位是否有腫塊形成;⑤檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)情況;⑥細(xì)胞凝聚實(shí)驗(yàn)，使用植物凝集素ConA檢測(cè)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化;⑦雙層軟瓊脂培養(yǎng)，使用雙層軟瓊脂培養(yǎng)基判斷細(xì)胞是否具有AIG特點(diǎn)(AIG∶即錨著獨(dú)立性生長，正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中必須附著于堅(jiān)韌的表面，而惡性細(xì)胞失去貼壁依賴性，可在半固體基質(zhì)中克隆)等檢測(cè)方法。

總之，干細(xì)胞的移植給醫(yī)學(xué)界帶來了希望，同時(shí)體外培養(yǎng)技術(shù)為干細(xì)胞的移植提供了可能性，但是由于干細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)過程中會(huì)受到外界因素的影響，所以在臨床應(yīng)用前還有很多的問題需要解決。找到成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)最合理的擴(kuò)增倍數(shù)，既能獲取大量純化的干細(xì)胞，又能保證在治療過程中的安全性和有效性，還需要進(jìn)一步的努力。

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