用苧麻生物脫膠廢水生產(chǎn)熱帶假絲酵母單細胞蛋白

王 軍，郝新艷，殷朝敏，蔡 蔭 ，曾慶福，阮新潮

（1. 武漢紡織大學 紡織印染清潔生產(chǎn)教育部工程研究中心，湖北 武漢 430073；2. 武漢紡織大學 環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430073）

用苧麻生物脫膠廢水生產(chǎn)熱帶假絲酵母單細胞蛋白

王 軍1，郝新艷1，殷朝敏2，蔡 蔭2，曾慶福1，阮新潮1

（1. 武漢紡織大學 紡織印染清潔生產(chǎn)教育部工程研究中心，湖北 武漢 430073；2. 武漢紡織大學 環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430073）

采用熱帶假絲酵母處理苧麻生物脫膠廢水。將COD為23 060 mg/L的苧麻生物脫膠廢水稀釋1倍后進行發(fā)酵處理，COD去除率最高，為60.85%。發(fā)酵條件的正交實驗結(jié)果表明：在發(fā)酵溫度為35 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時間為48 h的條件下，苧麻生物脫膠廢水COD去除率最高；發(fā)酵溫度為30 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時間為48 h的條件下，單細胞蛋白生成量最高。發(fā)酵時間為48 h時，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為75.75%，單細胞蛋白生成量為5.375 g/L；未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為72.25%，單細胞蛋白生成量為2.875 g/L。

熱帶假絲酵母；苧麻；生物脫膠；發(fā)酵；單細胞蛋白；廢水處理

苧麻纖維是我國重要的紡織原料之一。苧麻的主要化學組成是纖維素，質(zhì)量分數(shù)為65%～70%，其余為半纖維素、果膠、木質(zhì)素、水溶物、蠟脂質(zhì)、灰分等［1］，統(tǒng)稱為苧麻膠質(zhì)。苧麻膠質(zhì)影響纖維的可紡性［2］，必須從苧麻中脫除。苧麻脫膠有化學脫膠和生物脫膠兩種方法。化學脫膠成本高，對環(huán)境污染嚴重［3-4］。生物脫膠具有可提高精干麻質(zhì)量、不損傷纖維、無污染等優(yōu)點［5］，是苧麻脫膠技術(shù)的主要發(fā)展方向。苧麻經(jīng)生物菌液或酶液脫膠處理后，苧麻膠質(zhì)被降解成小分子多糖［5］，所以苧麻生物脫膠廢水屬于高濃度有機廢水，可生化性較強［6］。

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）體內(nèi)含有氧化分解酶，能降解可生化性較好的有機廢水，并同時獲得酵母蛋白，既消除了環(huán)境污染，又可使有機廢水得到綜合利用。目前熱帶假絲酵母已成功用于食品、造紙等工業(yè)廢水的處理［7-8］。

本工作利用熱帶假絲酵母處理苧麻生物脫膠廢水，同時生產(chǎn)單細胞蛋白，對苧麻生物脫膠廢水進行了綜合利用。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

未稀釋的初始苧麻生物脫膠廢水COD為23 060 mg/L。熱帶假絲酵母篩選自湖北天化麻業(yè)股份有限公司脫膠廠漚麻池的漚麻液。苧麻生物脫膠廢水取自武漢紡織大學環(huán)境科學研究所，經(jīng)脫膠微生態(tài)菌群［9］處理。所用試劑均為分析純。

保藏培養(yǎng)基［10］：酵母膏2.0 g，蛋白胨3.0 g，瓊脂粉 20 g，葡萄糖10 g，定容至1.0 L，121℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，牛肉膏 5 g，酵母粉5 g，蛋白胨20 g，氯化鈉5 g，定容至 1.0 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 m in。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在250 m L三角瓶中裝入 l00 m L適當稀釋的苧麻生物脫膠廢水，加入一定量質(zhì)量分數(shù)為0.3% 的（NH4）2HPO4溶液調(diào)節(jié)廢水pH，121 ℃滅菌20 min。

THZ-D型恒溫搖床：太倉試驗設備廠。

1.2 菌種鑒定

抽提菌種基因組總DNA，用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和引物NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）通過聚合酶鏈式反應（PCR ）擴增其26s rDNA［11］。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆到pMD18-T載體， 送北京三博遠志公司對26s rDNA基因序列進行測序。在 GenBank 的序列局部相似性查詢系統(tǒng)（BLAST）內(nèi)進行比對，對所得菌種進行鑒別。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的培養(yǎng)

用接種環(huán)將斜面上生長的菌種接入到裝有 50 m L種子液培養(yǎng)基的250 m L三角瓶內(nèi)，置于恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24～48 h，備用。

1.3.2 苧麻生物脫膠廢水的發(fā)酵處理

將種子液按一定的接種量（體積分數(shù)，下同）接入到不同初始COD的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于180 r/m in恒溫搖床上在一定溫度條件下發(fā)酵一定時間后測定其COD。

取一定量發(fā)酵后廢水，4 000 r/m in離心10 m in，去除上清液，剩余菌體用去離子水洗滌后，在 105 ℃烘箱中烘干至恒重，稱量菌體質(zhì)量，計算單細胞蛋白生成量（單位體積廢水中單細胞蛋白的質(zhì)量，g/L）。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌處理和未滅菌處理的效果對比

分別在經(jīng)過煮沸滅菌處理和未經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液，在發(fā)酵溫度為35 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%的條件下，連續(xù)發(fā)酵24 h后取樣測量廢水中COD和單細胞蛋白生成量，然后每隔6 h取樣分析，直至發(fā)酵時間達到48 h。比較發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌和不滅菌情況下的COD去除率和單細胞蛋白生成量。

1.4 分析方法

采用重鉻酸鉀法測定廢水COD［12］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的鑒定

測序獲得菌種的26 s rDNAD1/D2區(qū)段序列如下，與熱帶假絲酵母菌的序列相似度達98%，因此該菌種鑒定為熱帶假絲酵母菌［13］。

2.2 初始廢水COD對COD去除率的影響

初始廢水COD對COD去除率的影響見表1。

表1 初始廢水COD對COD去除率的影響

由表1可見，初始廢水COD為11 530 mg/L時，COD去除率最高，為60.85%，故將苧麻生物脫膠廢水稀釋1倍后進行發(fā)酵處理，COD去除效果最佳。這是因為苧麻生物脫膠廢水中含有大量單糖、多糖等有機分子，其濃度過低時沒有足夠的底物用于菌體生長；其濃度過高時，高濃度有機分子與抑制物的有害作用及其造成的滲透壓脅迫共同導致菌體生長受到抑制。

2.3 發(fā)酵條件的正交實驗結(jié)果

為優(yōu)化發(fā)酵條件，設計了4因素3水平的正交實驗L9（34）。 正交實驗因素水平見表2，正交實驗結(jié)果見表3。

表2 正交實驗因素水平

表3 正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果表明，各因素對廢水COD去除率的影響顯著性由強到弱順序依次為：A＞D＞B＞C，最優(yōu)方案為A1D2B3C3，即發(fā)酵溫度為35 ℃，初始發(fā)酵pH為7.0，接種量為 10%，發(fā)酵時間為48 h。

各因素對單細胞蛋白生成量的影響顯著性由強到弱順序依次為：B＞D＞C＞A，最優(yōu)方案為B3D2C2A1，即發(fā)酵溫度為30 ℃，初始發(fā)酵pH為7.0，接種量為 10%，發(fā)酵時間為48 h。

本研究中廢水COD去除率最高和單細胞蛋白生成量最高的發(fā)酵條件僅有發(fā)酵溫度存在差異。這可能是由于不同溫度下菌體利用的有機物和體內(nèi)的生理生化反應存在差異的原因，如COD的去除與三羧酸生成量有關(guān)系，而單細胞蛋白的產(chǎn)生與糖酵解途徑有關(guān)［14］。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌與否對廢水處理效果的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌與否對廢水處理效果的影響見圖1。由圖1可見：發(fā)酵時間少于30 h時，未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高；發(fā)酵時間超過36 h后，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高于未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵時間為48 h時，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為75.75%，未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為72.25%。這是因為未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌群組成復雜，熱帶假絲酵母雖然占有優(yōu)勢，但與其他菌種存在競爭，共同消耗廢水中的有機小分子，因而在發(fā)酵反應的前30 h其COD去除率比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高。發(fā)酵反應超過30 h后，由于未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中部分種類的細菌生長速度減慢，而且部分菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，因而其COD去除率比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率低。

由圖1還可見，發(fā)酵時間為48 h時，滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的單細胞蛋白生成量為5.375 g/L，未滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的單細胞蛋白生成量為2.875 g/L。這是因為滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中菌種單一，有利于熱帶假絲酵母的生長，故單細胞蛋白生成量較高。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌與否對廢水處理效果的影響

3 結(jié)論

a）采用熱帶假絲酵母處理苧麻生物脫膠廢水，將COD為23 060 mg/L的苧麻生物脫膠廢水稀釋1倍后進行發(fā)酵處理，COD去除率最高，為60.85%；

b）發(fā)酵條件的正交實驗結(jié)果表明：發(fā)酵溫度為35 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時間為48 h的條件下，廢水COD去除率最高；發(fā)酵溫度為30 ℃、初始發(fā)酵pH為7.0、接種量為 10%、發(fā)酵時間為48 h的條件下，單細胞蛋白生成量最高。

c）發(fā)酵時間少于30 h時，未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基比滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高；發(fā)酵時間超過36 h后，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率高于未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵時間為48 h時，滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為75.75%，單細胞蛋白生成量為5.375 g/L；未滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的COD去除率為72.25%，單細胞蛋白生成量為2.875 g/L。

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Production of Single Cell Protein from Ram ie Bio-degumm ing Wastewater Using Candida tropicalis

Wang Jun1，Hao Xinyan1，Yin Chaomin2，Cai Yin2，Zeng Qingfu1，Ruan Xinchao1

（1. Engineering Research Center for Cleaner Production of Textile Dying and Printing Under M inistry of Education，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073，China；2. School of Environmental Engineering，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073， China）

Ram ie bio-degumm ing wastewater was treated using Candida tropicalis. The wastewater with 23 060 mg/L of COD was diluted by 2 folds and treated by fermentation with the highest COD removal rate of 60.85%. The results of orthogonal experiments show that：Under the conditions of fermentation temperature 35 ℃，initial fermentation pH 7.0，inoculum dosage 10% and fermentation time 48 h，the COD removal rate is the highest；Under the conditions of fermentation temperature 30 ℃，initial fermentation pH 7.0，inoculum dosage 10% and fermentation time 48 h，the yield of single cell protein is the highest. When the fermentation time is 48 h，the COD removal rate and single cell protein yield with the sterilized fermentation medium are 75.75% and 5.375 g/L respectively，however，those with the unsterilized fermentation medium are 72.25% and 2.875 g/L respectively.

Candida tropicalis；ram ie；bio-degumm ing；fermentation；single cell protein；wastewater treatment

X703

A

1006-1878（2012）03 - 0255 - 05

2011 - 10 - 23；

2012 - 01 - 29。

王軍（1976—），男，山東省高唐縣人，博士，副教授，主要從事苧麻清潔生產(chǎn)方面的研究。電話027 - 87611776 ，電郵 Junwang@w tu.edu.cn。聯(lián)系人：阮新潮，電話 027 - 87611776 ，電郵 ruanxc72@163.com。

湖北省教育廳優(yōu)秀中青年科技人才項目（Q20 081704）；國家科技支撐計劃項目（2010BAD02B00）。

（編輯 祖國紅）