堿性成纖維細胞生長因子對骨基質明膠包埋血管束的促血管化作用

王瑞芳 秦書儉 程應斌 任占川

(山西醫(yī)科大學汾陽學院基礎部解剖教研室 山西汾陽 032200;①遼寧醫(yī)學院;②山西省孝義市人民醫(yī)院麻醉科)

骨折愈合是受多種因素影響的復雜過程，良好的血供對骨折的愈合是非常必要的。缺乏良好的血供將導致骨折延遲愈合和不愈合，因此，解決成骨區(qū)血管化的問題已經(jīng)成為當前研究的熱點和難點。本實驗旨在探討堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對骨基質明膠(BMG)包埋血管束的促血管化作用，為解決組織工程骨的血管化問題奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康5月齡日本大耳白40只，體質量1.5～2.0kg，雌雄不限。

1.2 BMG的制備 將4只日本大耳白兔10%水合氯醛腹腔麻醉過量致死后取四肢骨、髂骨，大量蒸餾水清洗后，參照Urist［1］的方法將四肢骨的骺端和髂骨制備成6mm×4mm×3mm的BMG。

1.3 實驗動物分組及BMG的植入方法 將36只日本大耳白兔隨機分為A、B、C3大組，每大組又分為4、8、12周3個小組。A組:將隱動靜脈游離1cm后順行植入用2μg/mL bFGF處理過的BMG的凹槽內(nèi);B組:將隱動靜脈游離1cm后順行植入BMG的凹槽內(nèi)，BMG不做任何預處理;C組則直接將未處理過的BMG植入，不必分離隱動靜脈。最后將移植區(qū)逐層縫合。術后5d每天用4萬U慶大霉素肌內(nèi)注射預防感染。

1.4 墨汁灌注及取材 分別于手術后4、8、12周取各組動物，10%水合氯醛腹腔麻醉后，游離腹主動脈、下腔靜脈，在腹主動脈離心插管。在下腔靜脈做一切口，放血同時往動脈內(nèi)注入大量肝素生理鹽水，直至靜脈遠端流出無色液體。然后從腹主動脈注入配好的復合墨汁(墨汁、甲醛及生理鹽水體積比為3:1:6)，遠端皮膚、趾甲均已變黑時結扎下腔靜脈兩端開口，繼續(xù)灌入少量復合墨汁，結扎動脈保持血管內(nèi)壓力。低溫放置24h后取出植入物置入4%多聚甲醛溶液中固定24h。

1.5 透明標本的制作及觀察 取固定好的植入物，A、B、C3個組每個時間點各取兩塊，脫鈣、去酸、漂白、脫水后二甲苯半透明和冬青油透明保存。用肉眼觀察移植物血管形成情況并攝像。

1.6 HE和Masson染色組織學觀察及定量分析 將剩余的固定好的植入物石蠟包埋、切片，厚度為5μm，分別進行HE染色和Masson染色，倒置顯微鏡下觀察血管化及成骨情況，攝像。根據(jù)體視學德萊塞原理，參照空間內(nèi)某特征物的面積分數(shù)是其體積分數(shù)的估計，以Masson染色組織片中血管的面積比來代表血管化水平，在每個蠟塊標本的上、中、下部分分別作連續(xù)橫向切片5片，置于顯微鏡下，以CIAS-1000細胞圖像分析系統(tǒng)測算其新骨面積比及血管面積比。在放大100倍的條件下，每張片子選取四角及中心5個區(qū)域最后得一平均值，代表該組織塊的血管面積比。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理所測得的數(shù)據(jù)，作多個樣本均數(shù)的兩兩比較，α=0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 一般情況 所有實驗動物術后4～6h蘇醒。術后切口無感染，下肢無壞疽，傷口Ⅰ期愈合，均存活至完成試驗。

2.2 透明標本大體觀察 A、B、C 3組從第4周開始均有少量新生血管從移植物邊緣長入支架材料孔隙內(nèi)，以后逐漸增多。A組移植物中央第4周時有小血管以芽生的方式從血管束中長出(圖1)，第8周時已經(jīng)逐漸向外周長入，并與邊緣長入的血管形成少量吻合(圖2)，第12周時從血管束中芽生的血管和從邊緣長入的血管已完全吻合。B組移植物中央第4周時有小血管芽生，但較A組4周時為少，第8周時增多，第12周時從血管束芽生的血管與邊緣長入的血管有少量吻合。C組移植物中央血管形成一直不太明顯。

2.3 組織學觀察 術后4周，3組移植物邊緣均有纖維結締組織和小血管形成，只有A組移植物中央有少量的血管。術后8周，3組移植物邊緣長入的纖維結締組織和小血管增多，血管排列紊亂，A組移植物中央血管量明顯增加。術后12周，A組位于其中的新生血管排列已經(jīng)比較有序(圖3)，B組的新生血管逐漸趨向于有序排列，C組新生血管排列還比較雜亂，主要集中于材料邊緣，中央較少(圖4)。

圖1 術后4周，A組透明標本

圖2 術后8周，A組透明標本

圖3 術后12周，A組 HE×200

圖4 術后12周，C組Masson×200

2.4 血管面積定量分析 移植物血管面積圖像分析結果見表1。從表中可以看出:4周時，A、B、C組之間互相差異都有顯著性(P＜0.05);8周時，A、B、C組之間互相差異都有顯著性(P＜0.05);12周時，A組與B、C組差異有顯著性(P＜0.05)。而且各組中隨著時間的延長，移植物血管面積逐漸增加。

表1 移植物血管面積比比較( s，%)

表1 移植物血管面積比比較( s，%)

注:與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，△P ＜0.05;與C組比較，#P ＜0.05

組別 4周 8周 12周A組 2.16±0.02△# 2.43±0.15△# 4.65±0.14△#B組 0.86±0.06*# 1.12±0.13*# 2.46±0.11*C組 0.16±0.02＊△ 0.51±0.09＊△ 1.30±0.12*

3 討論

長段骨干缺損修復難度大，主要與其特定解剖部位血供薄弱有關系。在骨修復中，微血管的長入，即血管化，能夠將成骨細胞前體細胞、相關因子、營養(yǎng)物質及其它參與骨修復的細胞攜帶到局部微環(huán)境中，并帶走局部新陳代謝產(chǎn)生的廢物，以及壞死和分解產(chǎn)物，從整體上維持有利于這一生理過程的代謝微環(huán)境［2］。

本實驗透明標本觀察可以看出，A組、B組在術后第4周時可見小血管以芽生的方式從血管束中長出，以后逐漸增多并開始向外周長入，術后第12周時與從材料邊緣長入的血管形成吻合。相反C組材料中央的血管形成一直到12周時都不太明顯。說明血管束植入的辦法可以促進血管化，血管束植入材料內(nèi)部以后縮短了再血管化的距離，比較符合生理上骨的血供特點。這與國內(nèi)外學者的研究結果是一致的:Philippe［3］將中空的復合骨髓基質細胞的珊瑚陶瓷材料置于大鼠大腿肌袋中，分離股動靜脈將其植入材料的管道內(nèi)，發(fā)現(xiàn)血管束的植入明顯促進了材料細胞復合物的血管化及成骨能力。

要實現(xiàn)組織工程骨的血管化，必須要有促血管生成因子的存在［4］。促血管生成因子很多，Norrby［5?描述了 38 種之多，主要有 VEGF、bFGF、Ang、PDGF、TGF、HGF、EGF 等。目前在動物模型實驗中廣泛使用的仍然是VEGF和bFGF。本實驗在植入血管束的基礎上，觀察到加bFGF的A組在術后第4周就可以看到小血管以芽生的方式從植入的血管束中長出，第8周時就已經(jīng)開始與邊緣長入的血管形成吻合，第12周時已經(jīng)完全吻合，實現(xiàn)完全血管化。組織學觀察和定量分析可以看出B組中央的血管在術后第4、8、12周一直少于A組，到術后第12周時A組的新生血管已經(jīng)形成有序排列，而B組的新生血管剛開始趨向于有序排列?？梢奲FGF對BMG包埋血管束有促血管化的正協(xié)同作用。成纖維細胞生長因子是一類對中胚層及神經(jīng)胚層來源的細胞具有強烈促增殖和分化作用的有多種生物學活性的多肽類細胞生長調(diào)節(jié)因子［6］。自1974年被美國著名生化學家Gospodarowicz分離、提純并命名以來，發(fā)現(xiàn)其不僅對成纖維細胞，而且對血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞以及神經(jīng)系統(tǒng)的星狀膠質細胞等都具有促增殖、分裂的生物學效應。近年來的研究表明［7，8］成纖維細胞生長因子家族中，等電點為9.6，分子量為25kD，由146個氨基酸組成的bFGF廣泛分布于人體的組織器官中，具有很強的生物學活性，因而在組織、細胞的增殖、分化中起著極其重要的作用。

雖然關于促血管生長因子的基礎研究報道已經(jīng)很多，但真正應用于臨床，尚有許多問題有待解決，如:①確切的使用劑量，就bFGF來說，不同的論文報告的bFGF的劑量有時竟相差100倍左右，作用于人體上，何為最低有效劑量，何為最佳有效劑量，還需要作更深入地研究;②簡便、有效的給藥方式，多數(shù)人主張連續(xù)多次給藥，以保持組織中有效的藥物濃度，更明智的方法是將bFGF置入一種緩釋裝置中再移植入局部組織中，使其長時間緩慢釋放藥力，發(fā)揮作用;③是應用一種促血管生長因子，還是多種因子聯(lián)合應用作用更佳。目前對組織工程骨血管化的方法和機理還不太明確，還要繼續(xù)深入廣泛的研究。

［1］Urist MR.Bone:formation by autoinduction［J］.Science，1965，150(698):893

［2］Bruder SP，F(xiàn)os BS.Tissue engineering of bone.Cell based strategies［J］.Clin Orthop Relat Res，1999，367:68

［3］Philippe P，Villars F，Mathoulin-Pelissier S.Influences of vascularization and osteogenic cell on heterotopic bone formation within a madreporic ceramic in rats［J］.Plast Reconstr Surg，2003，111(6):1932

［4］王 珍，羅靜聰，楊志明.組織工程化血管生長因子的研究［J］.中國臨床康復，2006，10(1):130

［5］Norrby K.Angiogenesis:new aspects relating to its initiation and control［J］.Nat Med，1995，1:1024

［6］Folkman J，Shing Y.Angiogenesis［J］.J Biol Chem，1992，267(16):10 931

［7］Wenger A，Stahl A，Weber H，et al.Modulation of in vitro angiogenesis in a three-dimensional spheroidal coculture model for bone tissue engineering［J］.Tissue Eng，2004，10:1536

［8］Slavin J.Fibroblast growth factors:at the heart of angiogenesis［J］.Cell Biol Inter，1995，19(5):431