局部外用酞丁安軟膏后皮內(nèi)濃度測定

吳黎莉 陳 沄 隗慧林 徐蘭芳 佘曉東 沈瓏瑛 潘顯道

酞丁安(ftibamzone)為我國首創(chuàng)的雙縮氨基硫脲類抗病毒藥，它不能直接抑制皰疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶，也不能直接滅活皰疹病毒，但可抑制病毒DNA和早期蛋白質(zhì)合成［1，2］;酞丁安對沙眼衣原體、HSV －1和HSV－2有強(qiáng)效抑制作用;此外，體外對金黃色葡萄球菌(包括青霉素高度耐藥的菌株)、鏈球菌、肺炎雙球菌等都有抑制作用，對皮膚癬菌具有一定抗真菌作用。研究表明酞丁安軟膏在大鼠局部皮膚上的毒性較低［3］。臨床給藥以局部外用為主，劑型有滴眼劑、搽劑、軟膏劑等，治療各型沙眼、單純皰疹、帶狀皰疹、尖銳濕疣、淺部真菌感染(體癬、股癬、手足癬等)。為了解酞丁安皮膚局部給藥后，藥物的皮膚滲透及進(jìn)入皮內(nèi)的藥物濃度水平，本試驗采用勻漿法結(jié)合高效液相色譜，測定試驗乳豬皮膚給藥后皮內(nèi)藥物濃度。

材料與方法

1．儀器與試劑:MS－1515高效液相色譜儀(美國Waters公司，配備M－2487紫外檢測器，7725i限量進(jìn)樣閥，Breeze色譜管理系統(tǒng))。酞丁安對照品(北京協(xié)和藥廠提供，批號050801，純度81%，避光保存)。酞丁胺軟膏(北京協(xié)和藥廠，批號060304，10g∶0．1g，標(biāo)示濃度1%)。N，N － 二甲基甲酰胺為分析純，甲醇、乙腈均為色譜純，三蒸水自制。

2．實驗動物:蘇中豬:江蘇省農(nóng)科院動物中心提供，剛斷乳小豬(20～30天，5．5～6．5kg)，合格證蘇01證字第01號。

3．方法:(1)酞丁安對照品液的配制:精密稱取酞丁安對照品6mg，置50ml棕色容量瓶，加1ml N，N－二甲基甲酰胺，完全溶解后加甲醇定容，備用。(2)色譜條件:色譜柱:Agilent zorbax SB－ C18(250mm ×4．6mm ID，5μm);流動相:甲醇∶水(55∶45);流速:1ml/min;紫外檢測波長:347nm;進(jìn)樣量 20μl;柱溫為室溫。(3)皮膚樣本處理:剪取給藥部位中心區(qū)域皮膚，去除皮下組織后稱重、剪碎成皮膚勻漿，置具塞試管。加1ml提取液(甲醇－N，N－二甲基甲酰胺49∶1)置4℃冰箱浸泡過夜。3000轉(zhuǎn)離心10min，上清液20μl進(jìn)樣分析。(4)方法的特異性:酞丁安與皮膚中的雜質(zhì)可完全分離，皮膚中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾酞丁安的測定。酞丁安對照品液(0．25μg/ml)、空白皮膚、試驗動物破損皮膚外用給藥1h后皮膚處理液的典型色譜圖見圖1。(5)線性范圍:精密量取酞丁安對照品液適量，分別用流動相稀釋成 0．02、0．05、0．1、0．2、0．5、1、2μg/ml的進(jìn)樣溶液。進(jìn)樣后記錄色譜圖，以酞丁安峰面積值A(chǔ)對樣品濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=55734×C－631．44，r=0．9999。表明酞丁安在0．02 ～2μg/ml范圍內(nèi)峰面積與濃度線性范圍良好。(6)精密度試驗:精密量取酞丁安對照品液適量，分別用流動相稀釋成0．2、2μg/ml的進(jìn)樣溶液。進(jìn)樣后記錄色譜圖，以酞丁安峰面積值計算測定精密度。結(jié)果表明用本法測定酞丁安濃度精密度良好，RSD分別為0.86%和3．2%。(7)穩(wěn)定性考察:精密量取酞丁安對照品液適量，置棕色容量瓶，用流動相稀釋成8μg/ml的進(jìn)樣溶液。分別正常日光放置及避光放置。于 0、2、4、6、8、10、25h 取樣進(jìn)行色譜分析。結(jié)果表明正常日光下酞丁安的穩(wěn)定性較差，酞丁安的峰面積值隨光照時間的延長，不斷地下降。采取避光措施后，酞丁安溶液的藥物濃度在10h內(nèi)能保持基本穩(wěn)定(圖2)。

4．試驗設(shè)計:(1)完整皮膚的經(jīng)皮滲透及皮內(nèi)藥物濃度測定:乳豬兩只，實驗前30min 30%氨基甲酸乙酯溶液(3ml/kg)腹腔注射麻醉，成功后固定。背部兩側(cè)正常皮膚剃除毛發(fā)后在預(yù)定區(qū)域分別于 0、2、3、4、5h 給 1% 酞丁安軟膏約 0．1g，給藥面積約2cm×2cm。全部區(qū)域給藥完畢后1h，處死動物。涂藥部位皮膚分別用1%N，N－二甲基甲酰胺水溶液仔細(xì)搽洗3次，取皮。另取未給藥部位皮膚及涂藥后立即洗凈皮膚，分別作空白對照和搽洗對照。乳豬背部給藥區(qū)域見圖3。(2)破損皮膚的經(jīng)皮滲透及皮內(nèi)藥物濃度測定:另取乳豬兩只，實驗前30min 30%氨基甲酸乙酯溶液(3ml/kg)腹腔注射麻醉，成功后固定。背部兩側(cè)皮膚剃除毛發(fā)后用梅花針敲擊50次，表皮微紅、輕度滲出。同上述正常皮膚試驗給藥。全部區(qū)域給藥完畢后1h，處死動物。涂藥部位皮膚分別用1%N，N－二甲基甲酰胺水溶液仔細(xì)搽洗3次，取皮。另取敲擊后破損皮膚的未給藥部位及涂藥后立即洗凈部位，分別作空白對照和搽洗對照。(3)皮內(nèi)藥物濃度計算:將完整皮膚與破損皮膚經(jīng)皮滲透試驗所得各皮膚樣本，按“皮膚樣本處理”項下皮膚樣本處理方法處理后進(jìn)樣分析，計算提取液中藥物濃度C(μg/ml)。根據(jù)以下公式計算不同時間點皮內(nèi)藥物濃度C皮內(nèi)(μg/g):C皮內(nèi)=C×V/W(其中V為提取液體積，W為去除皮下組織后皮膚樣本重量)。

圖3 乳豬背部給藥區(qū)域示意圖

結(jié) 果

完整皮膚及破損皮膚局部涂搽1%酞丁安軟膏后，不同時間采集的皮膚樣本藥物濃度測定結(jié)果見表1，皮內(nèi)濃度－時間曲線圖見圖4。皮膚組織藥物濃度測定結(jié)果表明，酞丁安軟膏外用于皮膚后，確實有一定量的經(jīng)皮吸收和滲透，但是吸收量相對較低。完整皮膚用藥后至6h，皮膚組織藥物濃度基本維持在0．5μg/g以下。

表1 酞丁胺皮內(nèi)濃度測定結(jié)果(n=4，μg/g)

表1 酞丁胺皮內(nèi)濃度測定結(jié)果(n=4，μg/g)

時間(h)完整皮膚 破損皮膚0－－1 0．5322 ±0．1898 0．3142 ±0．2606 2 0．2810 ±0．1346 0．5645 ±0．4369 3 0．6649 ±0．6282 0．4424 ±0．2730 4 0．3580 ±0．1324 0．2670 ±0．0830 6 0．3116 ±0．1667 1．9623 ±1．0077

討 論

圖4 局部外用1%酞丁安軟膏后的皮內(nèi)藥物濃度

根據(jù)以往研究報道，本文選用甲醇－水體系為流動相，以347nm為紫外測定波長，在此條件下酞丁安色譜峰峰形對稱，準(zhǔn)確度高，精密度與重現(xiàn)性好。內(nèi)源性的物質(zhì)不干擾酞丁安皮內(nèi)濃度的測定［4～6］。

不同種屬動物的皮膚組織結(jié)構(gòu)不盡相同，而豬的皮膚大體解剖上與人類十分相似。有學(xué)者研究探討了不同種屬動物皮膚對化學(xué)物質(zhì)的通透性，包括無毛小鼠、大鼠、家兔、小豬、豚鼠、恒河猴等，結(jié)果表明小豬皮膚對藥物滲透性與人體皮膚最為接近，大鼠和家兔的皮膚通透性明顯高于人類和小豬，用小豬進(jìn)行經(jīng)皮吸收試驗可很好地預(yù)期人經(jīng)皮吸收藥物結(jié)果。因此酞丁安的經(jīng)皮吸收試驗選用乳豬作為實驗動物［7］。

理論上用梅花針將表皮敲至微紅和輕度滲出，減少或消除了角質(zhì)層對藥物經(jīng)皮滲透的屏障作用，因此破損皮膚的藥物經(jīng)皮滲透應(yīng)高于完整皮膚。但本研究結(jié)果表明皮膚表皮的完整程度在給藥初期對藥物的經(jīng)皮滲透影響不大，破損皮膚外用給藥后1～4h的皮膚組織藥物濃度水平與完整皮膚無明顯差異。值得注意的是破損皮膚外用給藥6h后，皮膚組織的藥物濃度明顯增加，高于完整皮膚的數(shù)倍。這一結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是由于外用半固體制劑后，藥物首先要從基質(zhì)中釋放出來才能進(jìn)一步經(jīng)皮吸收。而藥物的釋放與化合物結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及基質(zhì)輔料成分有關(guān)，藥物的釋放量高是藥物經(jīng)皮吸收程度高的前提條件。如果藥物的釋放較為緩慢，就可能出現(xiàn)經(jīng)皮吸收高峰滯后的現(xiàn)象。雖然此時皮膚組織的藥物濃度明顯增加，但透過皮膚進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)的藥量仍然較少，皮膚作為藥物的儲庫作用較為明顯。

1 楊亞軍，趙敬華，潘顯道．抗病毒藥酞丁安及其衍生物構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36(12):13 －14

2 Yang YJ，Zhao JH，Pan XD，et al．Synthesis and antiviral activity of phthiobuzone analogues［J］．Chem Pharm Bull(Tokyo)，2010，58(2):208－211

3 李新宇，高紀(jì)偉，徐蘭芳，等．酞丁安乳膏在大鼠局部皮膚上的毒理實驗［J］．華西藥學(xué)雜志，2009，24(2):168－170

4 梁記芯．高效液相色譜法測定酞丁安滴眼液的含量［J］．海峽藥學(xué)，2006，18(2):80－82

5 余小平．高效液相色譜法測定酞丁安軟膏的含量［J］．藥物分析雜志，2005，25(3):356－357

6 陳建琴，陳秋虹．高效液相色譜法測定酞丁安搽劑的含量［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23(10):604－606

7 陳華．小型豬在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2003，13(3):175－178