CXCR4和MMP－9在胃癌組織中表達(dá)及其意義

徐 斌 韓紹偉 周笑珍 蔣 平 李利義

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居我國(guó)消化道惡性腫瘤的首位。淋巴及腹膜轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式，與胃癌的復(fù)發(fā)及預(yù)后關(guān)系密切［1］。研究證實(shí)，趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)與其配體CXCLl2間的相互作用在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用［2］。腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中必然破壞細(xì)胞外基膜(ECM)，而基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)是一種能降解ECM及其他基質(zhì)成分的重要蛋白酶，在促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法研究胃癌組織中趨化因子受體CXCR4和MMP－9的表達(dá)情況，并探討其與胃癌臨床病例分期的關(guān)系及兩者的相關(guān)性。

材料與方法

1．材料:76例胃癌組織標(biāo)本取自2009年1月～2010年12月在筆者醫(yī)院普外科行手術(shù)切除術(shù)患者，其中男性52例，女性24例，年齡26～79歲，平均年齡57．0±1．8歲。所有病例均術(shù)前及術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，術(shù)前均未行放化療。腫瘤分期按照2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布的胃癌TNM分期方案。術(shù)后10min內(nèi)每份標(biāo)本取材于腫瘤組織，癌旁正常胃組織(距腫瘤組織邊緣＞5cm，做正常對(duì)照)，全部標(biāo)本取材后迅速置于10%中性甲醛中固定，備用。

2．試劑:鼠抗人CXCR4抗體購(gòu)至美國(guó)Sigma公司，兔抗人MMP－9抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，免疫組化S－P試劑盒購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司。

3．方法:(1)CXCR4和MMP－9蛋白表達(dá)的檢測(cè):采用S－P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。具體步驟:所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制備5μm厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟、水化，0．3%的H2O2去離子水孵化15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。組織抗原修復(fù)10min(用pH 6．0的0．01mol/L檸檬酸緩沖液，于微波爐中94℃加熱，每次5min，共2次)，正常羊血清封閉，分別加入CXCR4(工作濃度1∶50)和MMP－9(工作濃度為 1∶150)，37℃ 孵育 2 ～3h，PBS 充分洗滌(5min×3次);滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫37℃孵育30min，PBS再次沖洗(5min×3次);滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫37℃孵育30min，PBS漂洗后DAB顯色;蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。操作過程中嚴(yán)格質(zhì)控。用已知陽性的胃癌切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗，作為陰性對(duì)照。

(2)結(jié)果判斷:CXCR4和MMP－9均為胞膜或胞質(zhì)表達(dá)，以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)呈棕黃或棕褐色者為陽性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野讀取200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性率，并取平均值。所有切片均用盲法計(jì)數(shù)。陽性表達(dá)判斷參照Mattern等［3］的計(jì)數(shù)方法，按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率來計(jì)算評(píng)分。染色強(qiáng)度:無著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，深棕色為3分;陽性細(xì)胞率:陽性率＜1%為0分，陽性細(xì)胞率＜25%為1分，陽性細(xì)胞率25% ～50%為2分，陽性細(xì)胞率＞50%為3分。染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率評(píng)分之和即為最后得分:0～1分為陰性(－)，2～3分弱陽性(+);4～5分為陽性(++);＞5分為強(qiáng)陽性(+++)。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 15．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Fisher確切概率法分析CXCR4和MMP－9表達(dá)與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性;CXCR4與MMP－9相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．CXCR4和MMP－9在不同胃組織中的表達(dá)情況:CXCR4在癌旁正常胃組織中無陽性表達(dá)，在76例胃癌組織中有42例表達(dá)陽性，表達(dá)率為55．26%(圖1)。MMP－9在癌旁正常胃組織陽性表達(dá)率為15.79%(12/76)，在胃癌組織中陽性表達(dá)率為67.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．000)(圖2)。各組腫瘤組織切片經(jīng)PBS代替特異性一抗作為空白對(duì)照，腫瘤組織鏡下均無陽性表達(dá)。

圖1 CXCR4在胃癌組織中的表達(dá)(×400)

圖2 MMP－9在胃癌組織中的表達(dá)(×400)

3．CXCR4和MMP－9表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系:CXCR4和MMP－9的陽性表達(dá)水平與胃癌的組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p＜0．05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位無關(guān)(P＞0．05)(表1)。

表1 CXCR4、MMP－9蛋白表達(dá)與胃癌的臨床病例參數(shù)的關(guān)系

3．胃癌組織中CXCR4與MMP－9表達(dá)的關(guān)系:胃癌組織CXCR4的陽性表達(dá)水平與MMP－9的陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0．406，P=0．000)(表2)。

表2 胃癌中CXCR4與MMP－9表達(dá)的關(guān)系

討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性，是腫瘤患者致死的主要原因，亦是判斷患者預(yù)后和確定治療方案的重要依據(jù)。趨化因子是可受化學(xué)誘導(dǎo)物及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)、并能刺激細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的一類低分子蛋白質(zhì)。在正常和病理狀態(tài)下細(xì)胞沿著趨化因子濃度增加的信號(hào)向趨化因子源處的遷徙。研究表明，不同腫瘤細(xì)胞高表達(dá)特異的趨化因子配體，而一些靶器官則相應(yīng)的高表達(dá)其趨化因子受體，腫瘤細(xì)胞沿著趨化因子信號(hào)向相應(yīng)的靶器官轉(zhuǎn)移，憑借趨化因子配體和受體的特異性結(jié)合，最終完成特異性轉(zhuǎn)移可能與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)［4］。

CXCR4是一個(gè)編碼352個(gè)氨基酸且高度保守的G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體，CXCL12又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 －1(stromal cell－derived factor－1，SDF－1)，屬于CXC族趨化因子成員。趨化因子CXCLl2與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物學(xué)軸(CXCL12/CXCR4 biological axis)在多種腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［5］。有研究表明，人乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位如淋巴結(jié)、肺、肝等則高表達(dá)其配體CXCL12，并且來自這些組織的蛋白提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞有明顯的趨化作用［6］。這一現(xiàn)象在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌中亦得到證實(shí)［7～9］。Yasumoto 等［10］發(fā)現(xiàn)胃癌組織中 CXCR4的表達(dá)增高，提示CXCR4參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究顯示，CXCR4在胃癌組織中的陽性表達(dá)明顯高于正常胃組織，提示CXCR4在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，CXCR4的陽性表達(dá)與胃癌的組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示CXCR4陽性表達(dá)與胃癌組織的惡性程度、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。說明CXCR4表達(dá)高的癌細(xì)胞更容易侵入淋巴管，形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;CXCR4表達(dá)高的癌細(xì)胞可以藉趨化因子配體與受體間相互作用，促進(jìn)其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracllular matrix，ECM)的降解和基膜的破壞是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的先決條件?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP－s)能降解ECM，破壞基膜，促進(jìn)腫瘤血管新生，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［11］。MMP－9是MMP家族重要成員之一，可降解細(xì)胞外多種基質(zhì)成分，如Ⅳ型膠原、蛋白多糖、層黏蛋白及纖維連接蛋白等，并通過降解、破壞腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)和基膜、促進(jìn)新生血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵犯鄰近器官的組織、淋巴管和小血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［12］。研究顯示，MMP－9在胃黏膜的表達(dá)是胃癌發(fā)生的晚期事件，是胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生惡變的標(biāo)志［13］。MMP－9的過度表達(dá)對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，其表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［14，15］。在本研究結(jié)果現(xiàn)顯示，MMP －9 在人胃癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃組織，且與胃癌的組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)。說明MMP－9表達(dá)較高的腫瘤組織具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力;腫瘤的侵襲伴隨基膜的破壞;MMP－9可以用來反映胃癌惡性程度的高低，并且能夠成為評(píng)估胃癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。

分析CXCR4和MMP－9在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CXCR4的陽性表達(dá)同MMP－9的陽性表達(dá)呈正相關(guān)。因此筆者推測(cè)兩者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中存在協(xié)同作用。其可能的機(jī)制如下:①CXCR4介導(dǎo)MMP－9分泌，而MMP－9進(jìn)一步降解Ⅳ型膠原纖維而破壞基膜和誘發(fā)新生血管形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移:Samara等發(fā)現(xiàn)CXCR4可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員，活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK－1/2)，介導(dǎo)MMP－9的分泌;②CXCR4通過激活MMP－9活性促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移:Brand等等對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)CXCLl2與CXCR4通過相互作用激活ERK－1/2、SAPK/JNK，Akt和MMP－9，進(jìn)一步介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組，最終促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移;③CXCR4和MMP－9存在共同的信號(hào)通路:Helbig等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外信號(hào)激活轉(zhuǎn)錄因子NF－κB可直接上調(diào)CXCR4的表達(dá)，F(xiàn)arina等發(fā)現(xiàn)NF－κB也可以促進(jìn)MMP－9酶原的分泌，因此，二者可能存在共同的信號(hào)通路，通過共同的信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，CXCR4和MMP－9的陽性表達(dá)同胃癌分化程度，腫瘤浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移之間的密切相關(guān)。CXCR4的陽性表達(dá)和MMP－9的陽性表達(dá)呈正相關(guān)，二者在促進(jìn)胃癌的發(fā)展過程中具有協(xié)同作用。聯(lián)合檢測(cè)CXCR4和MMP－9可能對(duì)判斷胃癌的預(yù)后有重要參考價(jià)值。

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