間充質干細胞和免疫抑制劑的相互作用

趙紅州 黃梁滸

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，幾乎存在于人體所有組織，最早從骨髓中分離得到[1-3]。研究發(fā)現，MSCs免疫原性弱，體外不誘發(fā)免疫應答［4-6］，而且MSCs具有獨特的多譜系分化特性和天然的免疫抑制與調節(jié)功能，以及強大的組織修復能力［1］，凸顯其作為種子細胞應用于再生醫(yī)學的潛能。實體器官移植是治療重要臟器功能衰竭的主要方法，而免疫抑制劑的廣泛使用提高了移植物的存活率，但同時也帶來感染增加、毒副作用強等不良后果[7]。MSCs作為免疫調節(jié)劑，通過抑制淋巴細胞增殖、抑制抗原呈遞細胞分化成熟而發(fā)揮其獨特的免疫抑制作用，使其在器官移植方面顯現出潛在優(yōu)勢和良好應用前景[8-11]。但是由于MSCs廣泛存在，一方面在移植中MSCs不可避免地會曝露在免疫抑制藥物作用之下，使其免疫調理的作用受到影響[9，12]；另一方面MSCs表達多種免疫抑制劑的分子作用靶位，如鈣神經素（calcineurin，CNI）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和肌苷5'-磷酸脫氫酶（inosine 5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH），免疫抑制劑與其受體結合后作用于上述分子作用靶位，從而影響MSCs的生物學特性及其功能[13-15]。但兩者之間相互影響究竟如何以及二者相互作用的機制尚無定論，本文就這些方面研究作一綜述。

一、免疫抑制藥物對MSCs的影響

1.免疫抑制藥物對MSCs多向分化潛能的影響：體外實驗證實，免疫抑制藥物可以影響MSCs誘導成成骨細胞、成脂肪細胞等的能力[1，16-20]。在MSCs培養(yǎng)體系中加入免疫抑制劑CNI類[環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）與他克莫司]、霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）和雷帕霉素共培養(yǎng)，免疫抑制劑基本不影響MSCs的免疫表型，而影響其向成骨細胞、成脂肪細胞分化的能力。在MSCs成骨、成脂誘導體系中分別加入不同濃度梯度的免疫抑制劑他克莫司（1，10，100 ng/ml）、MPA（1，10，100 μg/ml）、雷帕霉素（0.1，1，10，50 ng/ml）和CsA(10，100，500 ng/ml)。結果顯示成骨誘導體系對照組有明顯的鈣鹽礦物質沉積，而加入不同濃度梯度MPA和他克莫司處理組鈣鹽沉積減少，尤其是加入MPA濃度在10 μg/ml時鈣鹽沉積減少最明顯，表明上述兩種免疫抑制劑抑制了MSCs向成骨細胞分化，而雷帕霉素對MSCs成骨分化的影響無統(tǒng)計學差異。與成骨誘導結果相反，在MSCs向成脂誘導分化時，雷帕霉素明顯增強了MSCs的成脂能力，而MPA和他克莫司對其成脂無明顯的影響[18-23]。

2.免疫抑制藥物對MSCs免疫調節(jié)作用的影響：Buron等[21]證實體外MSCs表達免疫抑制活性。在混合淋巴細胞反應體系中，反應細胞和刺激細胞皆來源于人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，加入第 三 方MSCs細胞做混合淋巴細胞培養(yǎng)，結果顯示MSCs以一種劑量和時間依賴的方式，而非MHC限制的方式抑制T淋巴細胞增值。研究發(fā)現在MSCs抑制T細胞增殖的分子機制中，與MSCs共培養(yǎng)的T細胞周期被抑制在G0/G1期，T細胞中促進G1/S期轉換的周期蛋白CyclinD2表達下調，而抑制細胞增殖的蛋白p27KiPl上調，MSCs 的這種調節(jié)作用并不是針對T細胞某個亞群，而是抑制所有種類的 T 細胞增殖[17，23-28]。

在混合淋巴細胞反應體系中將作為第三方的MSCs與PBMC來源的反應細胞以終濃度分別為1:20、1:10和1:5之比例混合，并加入不同濃度梯度的免疫抑制劑（含正常血藥濃度）共培養(yǎng)。結果表明當兩者比值為1:20時，MSCs對淋巴細胞增殖的抑制作用有限，淋巴細胞增殖被抑制的程度不足50﹪，然而CsA、MPA、他克莫司和雷帕霉素等免疫抑制劑都隨著藥物濃度增加以劑量依賴的方式增強MSCs對T細胞的免疫抑制效應；然而MSCs與反應細胞比值為1:10和1:5時，MSCs自身就成了一種強免疫抑制劑，對淋巴細胞增殖起到抑制作用，這種情形下藥物對MSCs作用表現出多樣性：（1）CsA出現拮抗MSCs抑制效應的現象，兩者比值1:10時，在無免疫抑制劑存在的情況下MSCs自身抑制80﹪的淋巴細胞增殖，使得淋巴細胞增殖水平只有對照組的20﹪，然而在加入10 ng/ml或100 ng/ml CsA后MSCs對淋巴細胞增殖的抑制作用減弱，淋巴細胞增殖水平為對照組的40﹪，MSCs與反應細胞比值1:5時一樣；（2）他克莫司、雷帕霉素對MSCs的作用類似CsA；（3）MPA促進MSCs抑制作用，MSCs與反應細胞比值1:10或1:5時，MPA隨著劑量的增加對MSCs表現出協(xié)同作用，促進其抑制增殖作用［18，29］。

3.免疫抑制藥物對MSCs細胞活性的影響：MSCs 5000/孔種植于96孔板，分別加入1，10，100 ng/ml他克莫司，1，10，100 μg/mlMPA，0.1，1，10，50 ng/ml雷帕霉素，在標準條件下共培養(yǎng)24 h和7 d，用MTT法檢測活細胞數量。結果發(fā)現24 h內幾種藥物對MSCs存活幾乎無影響；當MSCs與上述藥物共培養(yǎng)了7 d后，觀察結果提示他克莫司在濃度100 ng/ml時能顯著降低MSCs活細胞數量，而MPA在濃度100 μg/ml時也能夠降低MSCs的活細胞數量，但程度比他克莫司弱的多[21-23，30]。

MSCs以2×105/孔種植于6孔板，分別加入10 ng/ml他克莫司、10 μg/ml MPA、10 ng/ml雷帕霉素，不加藥物組作為對照均在標準培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至第48小時和第7天，胰酶消化，收集細胞，使用凋亡檢測試劑盒annexin V染色，流式細胞儀檢測凋亡細胞比值。結果發(fā)現3種藥物分別對MSCs凋亡的影響與對照組差異無統(tǒng)計學意義[30-32]。

4.免疫抑制藥物對MSCs細胞增殖的影響：MSCs以103/孔種植于96孔板，在MSCs培養(yǎng)體系分別加入上述不同濃度免疫抑制藥物，以培養(yǎng)到第3天和第7天作為觀察時間點。在觀察前12h分別摻入0.5 uCi /孔3H-胸腺嘧啶脫氧核苷，以閃爍計數儀對增殖細胞分別定量測定MSCs的增殖情況。結果發(fā)現他克莫司對MSCs的增殖影響差異無統(tǒng)計學意義；3種不同濃度的MPA均能顯著降低MSCs增殖能力，第3天測定時在濃度10 μg/ml時MSCs增殖能力降低最明顯，降低了90﹪，第7天時結果相似；雷帕霉素則以一種劑量依賴的方式影響MSCs增殖，其濃度大于10 ng/ml時能顯著降低MSCs增殖[32-34]。

二、MSCs對免疫抑制藥物的影響

MSCs在達到一定的濃度時，也表現出強的免疫抑制活性[9-10，22]。Bartholomew 等[35]對進行皮膚移植的狒狒輸注供者狒狒的MSCs，發(fā)現可延長移植皮膚的存活時間，其效果可和環(huán)孢素媲美；即便是第三方來源的MSCs也有類似效果。對異體活體肝移植狗的研究發(fā)現，對照組僅做活體肝移植，處理組在活體肝移植的基礎上，經門靜脈輸注自體骨髓 MSCs，輸注 MSCs組具有更長的生存率(P < 0.001)，肝功能指標更低 (P < 0.01)，但MSCs輸注組與對照組相比排斥反應發(fā)生率相似。在腎移植等其他實體器官移植的試驗中也有相關使用MSCs可減低排斥反應發(fā)生率的報道。MSCs減輕實體器官移植排斥反應的機制比較復雜，在心臟移植的動物試驗中發(fā)現，MSCs可移行至發(fā)生慢性排斥反應的異體心臟，因此推測MSCs可能具有局部免疫抑制作用[33]。

由于MSCs具有免疫抑制活性，與免疫抑制藥物一同作用發(fā)揮免疫抑制活性時可能會出現協(xié)同增強作用或拮抗作用，抑或相互無影響。在混合淋巴細胞反應，MSCs對低濃度的免疫抑制藥物的免疫抑制效應有促進作用；MSCs拮抗高濃度的CNI類免疫抑制劑的免疫抑制效應，但是CsA在500 ng/ml工作濃度時，MSCs對其無影響；MSCs與MPA有協(xié)同效應，MSCs能夠增強MPA對淋巴細胞增殖的抑制效應，在大鼠心臟移植試驗中發(fā)現，MSCs結合低劑量MPA，可誘導心臟異體移植后動物的免疫耐受，試驗組大鼠的移植心臟平均存活時間達100d以上，而對照組僅為13d。實驗還發(fā)現，MSCs與MPA協(xié)同效應與MPA濃度無相關性[22，31]。

三、MSCs免疫抑制活性的機制和MSCs與免疫制劑相互作用的可能機制

圖1 MSCs與其他免疫細胞的相互作用[30]

盡管靶細胞和MSCs通過直接接觸相互作用是MSCs發(fā)揮免疫抑制活性的一個重要因素，但細胞與細胞之間直接接觸并非必需。通過其他免疫細胞分泌的多種細胞因子共同活化MSCs，誘導其分 泌 如 INF-γ、TGF-β、PGE-2、IL-10、TNF-α、IL-1、NO等多種可溶性炎癥因子從而發(fā)揮其免疫抑制活性被認為是MSCs發(fā)揮其免疫抑制作用的主要機制（圖1）。低濃度IFN-γ可上調MSCs表面MHCⅡ類分子的表達，但隨著IFN-γ的水平升高，其Ⅱ類分子的表達量降低，其抗原提呈能力也逐漸下降。這使得MSCs在免疫反應早期，IFN-γ水平較低時，表現為APC的功能，隨著IFN-γ水平的增高 ，MSCs的功能就轉化為免疫抑制了[23，28]。有文獻報道MSCs體外能調節(jié)B細胞、T細胞、DC細胞和NK細胞活性。T淋巴細胞是實體器官移植排異的關鍵效應細胞。體外試驗也表明MSCs對CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞有抑制作用，MSCs體外可抑制T細胞增殖，誘導CD4+T細胞向Th2方向分化，并可誘導出具有抑制功能的T細胞亞群，從而阻斷T細胞對刺激細胞的應答，阻斷前體T細胞發(fā)育為CD8+T細胞，且抑制CD8+T細胞的殺傷功能，體內抑制記憶性T細胞的增殖、細胞毒性反應，以及抑制產生IFN-γ的T細胞數量等，但有關體內MSCs對T淋巴細胞的影響，受目前資料所限尚無確切證據。樹突狀細胞（dendritic cells ，DC）在實體器官移植排斥反應中起著重要作用，MSCs可以通過改變DC的成熟度，促進其向調節(jié)性表型轉化，因此很有可能以此影響DC的功能，達到免疫抑制的作用。對小鼠和人類 MSCs的體外研究發(fā)現MSCs還可以抑制B淋巴細胞的增殖、分化和趨化作用，且這種作用至少部分地與可溶性因子有關，如INF-γ、TGF-β 等[23-28，36-38]。

研究證實，MSCs表達多種免疫抑制劑的分子作用靶位，如CNI、mTOR和IMPHD等。（1）CNI在MSCs和T細胞上都有表達，能夠活化T細胞并且在MSCs成骨、成軟骨分化過程中起重要作用，而他克莫司和CsA則是CNI的抑制劑，二者通過抑制CNI活性，破壞在T細胞活化方面起重要作用的細胞因子如IL-2、IL-4等基因的表達，從而阻斷T細胞活化，并抑制MSCs成骨、成軟骨分化；（2）mTOR是雷帕霉素的分子作用靶位，mTOR與雷帕霉素結合后能夠通過不同的細胞因子受體阻斷信號傳導，阻斷MSCs由G1期至S期的進程，在MSCs增殖、分化和存活等過程中起到重要作用；（3）作為細胞周期阻斷劑的活性代謝產物之一的MPA，其分子作用靶位為IMPHD，而且發(fā)現MPA能夠顯著抑制MSCs增殖，其可能機制是：IMPHDⅡ亞型僅表達于活化的淋巴細胞和MSCs，而且MSCs高表達Ⅱ亞型，其他細胞則只表達IMPHD Ⅰ亞型，有文獻報道MPA與IMPHD Ⅱ亞型的親和力顯著強于IMPHD I亞型，因此MPA對Ⅱ亞型的抑制作用也強于Ⅰ亞型，MPA對MSCs則表現為顯著抑制其增殖、分化[21-24，38]。綜上所述，免疫抑制劑通過與MSCs上表達的多種免疫抑制劑的分子作用靶位相結合，從而發(fā)揮其免疫抑制效應，這可能就是免疫抑制劑抑制MSCs增殖、分化和影響MSCs細胞周期的一種機制。

目前免疫抑制劑與MSCs兩者相互作用機制尚無定論，但目前存在一個得到多數研究人員認可的假說：CNI類抑制淋巴細胞的活化和炎癥因子的釋放，這些炎癥因子尤其是IFN-γ和炎性微環(huán)境是MSCs發(fā)揮免疫抑制效應必須的，因此，CNI類通過抑制其他免疫細胞釋放MSCs活化必須的炎癥因子和抑制炎性微環(huán)境，從而表現出抑制MSCs活化、增殖、分化和存活的效應[21-24，29]。MSCs分泌釋放INF-γ、TGF-β、IL-10 等可溶性炎癥因子，在與免疫抑制劑一同作用時可能會出現協(xié)同增強作用或拮抗作用。

四、總結與展望

由于MSCs的免疫抑制和免疫調節(jié)性，使其成為有良好應用前景的器官移植治療新手段。而且在骨髓移植中還發(fā)現同源性MSCs能促進移植物植入和降低移植排斥的發(fā)生，異源性MSCs阻礙移植物植入[39]。雖然目前MSCs的相關研究結果令人鼓舞，但仍有大量問題無法回避：（1）MSCs的來源：盡管源于骨髓、脂肪、臍帶等的 MSCs功能相似，但不同來源的MSCs其某些CD分子表達不完全一致，且脂肪來源的MSCs在傳代過程中相對容易出現染色體改變[40-41]；（2）干細胞的定位和作用機制仍然不清楚，干細胞進入血循環(huán)后，如何通過腎小球基底膜屏障到達靶部位進行分化和修復，也是亟待解決的問題[42]；（3）在實體器官移植中免疫抑制劑和MSCs相互影響，有的與MSCs表現協(xié)同作用，而有的與MSCs相互拮抗，兩者之間的作用機制有待進一步闡明，如何用藥、如何規(guī)避風險提高移植器官存活率等尚無統(tǒng)一的觀點。盡管如此，關于MSCs的研究目前已然成為臨床熱點。隨著基礎研究的深入及臨床試驗資料的不斷完善，MSCs作為一種新的免疫調節(jié)劑展現良好的應用前景，將可能成為一種理想的細胞治療手段。

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