大鼠自體胸腺腎的功能研究

趙大強(qiáng) 陳立中 李軍 邱江

胸腺是中樞性免疫器官，發(fā)揮對T淋巴細(xì)胞的選擇發(fā)育功能。胚胎豬胸腺可以選擇發(fā)育人造血干細(xì)胞，通過胸腺移植，可使供體的胸腺在受體體內(nèi)選擇發(fā)育受體T淋巴細(xì)胞從而誘導(dǎo)受體對供體特異性免疫耐受[1-2]。已有的研究表明胸腺對免疫耐受的形成是至關(guān)重要的[3-8]。在應(yīng)用異體胸腺組織移植來誘導(dǎo)免疫耐受時(shí)，由于胸腺富含供體組織抗原，導(dǎo)致移植的胸腺受到強(qiáng)烈排斥而引起免疫耐受誘導(dǎo)失敗，因此受體術(shù)前去胸腺是必要的。即便如此，胸腺組織移植仍不能誘導(dǎo)免疫耐受的穩(wěn)定形成，但如果把胸腺作為一個(gè)帶血管器官來移植則能更好地誘導(dǎo)免疫耐受的形成。為了達(dá)到這一目的，已有的研究嘗試了兩種非常有創(chuàng)意的途徑，一是“胸腺腎（thymokidney，TK）”移植[9-11]，二是帶血管的 “胸腺小葉”移植[12-15]，均取得了良好的效果。小型豬構(gòu)建TK術(shù)后60d移植胸腺組織能恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)，并支持胸腺細(xì)胞的發(fā)育[16]，但TK在移植之前其胸腺功能如何還沒有報(bào)道。本研究嘗試用大鼠建立了自體TK模型，并觀察在進(jìn)行TK移植之前移植胸腺的功能。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及麻醉方法

SD大鼠32只，雄性，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。麻醉采用10﹪水合氯醛0.3ml/100 g腹腔注射。

二、手術(shù)設(shè)備

小動物呼吸機(jī)TKR-200C（江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司）1臺、氧氣瓶、手術(shù)顯微鏡（SXP-1B，上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠），顯微器械及普通手術(shù)器械，流式細(xì)胞儀等。

三、實(shí)驗(yàn)分組及手術(shù)方法

1.Ⅰ組：去胸腺組（12只，體質(zhì)量150～250 g）。沿頸中線剪開皮膚及皮下組織，氣管插管，小動物呼吸機(jī)連接氧氣瓶支持大鼠呼吸。于胸骨柄中點(diǎn)剪開胸骨1.5～2 cm，暴露胸腺表面、胸膜和兩側(cè)肺上極，顯微鏡下直接撕破雙側(cè)胸膜上極，從底部翻起左右胸腺兩葉，向上游離去除胸腺。仔細(xì)檢查并摘除殘留胸腺，止血完畢，前縱隔放置引流管關(guān)閉胸腔。脫機(jī)后吸盡氣管滲液，縫合氣管，縫合皮膚后負(fù)壓吸引引流管片刻后拔掉引流管。2個(gè)月后隨機(jī)選取5只長期存活大鼠加去脾臟手術(shù)作為第Ⅳ組。

2.Ⅱ組：TK組（15只，體質(zhì)量150～250 g）。在Ⅰ組的手術(shù)基礎(chǔ)上繼續(xù)手術(shù)，摘除的胸腺放0～4℃生理鹽水中保存。沿劍突到恥骨聯(lián)合上取腹正中切口，暴露左腎，在左腎表面中下1/3處用顯微無齒鑷輕輕橫行撕開約0.5 cm腎包膜，用鑷子探進(jìn)腎包膜下進(jìn)行適當(dāng)游離。把摘取的2胸腺兩葉從正中分開，取一葉剪成3～4片，主要在于剪薄，分別輕輕放入腎包膜內(nèi)，直到放滿整個(gè)腎包膜。相同的方法行右側(cè)腎包膜下自體胸腺移植，構(gòu)建雙側(cè)自體TK。復(fù)位腸管，關(guān)閉腹腔。

3.Ⅲ組：假手術(shù)組（5只，體質(zhì)量50～100 g）。模仿Ⅱ組進(jìn)行開胸、開腹、氣管插管通氣手術(shù)，開胸見到胸腺后并不撕破胸膜去除胸腺，撕破腎包膜后不行胸腺移植。

四、檢測、觀察指標(biāo)

1.術(shù) 后 0、1、2、3、4、6、8、12及 16周，3組動物分別抽取外周血，使用流式細(xì)胞儀檢測外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8+T細(xì)胞和CD4-CD8-T細(xì)胞所占的比例及變化情況。其中Ⅰ組在第8周時(shí)加去脾臟的5只大鼠加測10周時(shí)的流式檢測。

2.Ⅱ組術(shù)后2周、4周、6周、8周、3個(gè)月、4個(gè)月分別處死大鼠1～2只，顯微鏡下觀察雙側(cè)腎包膜下移植胸腺血管重建情況，留取標(biāo)本，行組織形態(tài)學(xué)檢查。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組不同時(shí)間點(diǎn)的流式檢測結(jié)果繪制均數(shù)線圖。PBMC不同分化T淋巴細(xì)胞所占平均比例用表示，術(shù)后3個(gè)月時(shí)流式檢測結(jié)果的組間差異采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

TK組術(shù)后2周已見到明顯有血管自腎門生長入腎包膜下的胸腺組織中，扇形分布，左側(cè)腎包膜下血供重建優(yōu)于右側(cè)，胸腺組織由移植時(shí)淤血顏色變成白色正常胸腺組織顏色，6～8周時(shí)移植胸腺組織增厚(圖1)，組織學(xué)檢查能見到正常胸腺組織結(jié)構(gòu)（圖2）。撕破的腎包膜在14 d時(shí)已完全重建。

腎包膜下移植的胸腺3～4個(gè)月后逐漸退化，表現(xiàn)為移植的胸腺組織中淋巴細(xì)胞減少，逐漸為脂肪細(xì)胞替代（圖3）。

PBMC中不同分化T淋巴細(xì)胞的變化：（1）Ⅰ組和Ⅱ組術(shù)后6周內(nèi)流式檢測結(jié)果變化基本一致，6周后出現(xiàn)明顯的分化，表現(xiàn)為Ⅰ組CD4-CD8-T淋巴細(xì)胞比例仍持續(xù)上升，在第8周Ⅳ組中升高得更明顯，而Ⅱ組6周后開始逐漸下降（圖4a，表1）。Ⅰ組成熟的單陽性（CD4+T和CD8+T）淋巴細(xì)胞在術(shù)后6周后繼續(xù)下降，而Ⅱ組開始回升（圖4b、4d；表 2、3）。Ⅰ組 CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞在術(shù)后6周后仍有波動，后續(xù)的檢測顯示呈低水平，而Ⅱ組6周后較平穩(wěn)（圖4c，表4）；(2)Ⅲ組與實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ在術(shù)后早期就呈現(xiàn)明顯差異，但能看到術(shù)后1～3周內(nèi)雙陰性T淋巴細(xì)胞比例是下降的，成熟的單陽性細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常，雙陽性T淋巴細(xì)胞所占比例明顯高于實(shí)驗(yàn)組（圖 4） ；(3)去胸腺后 1～3周內(nèi)，CD4+T 淋巴細(xì)胞先上升后回降，CD8+T淋巴細(xì)胞先下降后回升（圖4b、4d）。術(shù)后12周，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅳ組之間PBMC中CD4-CD8+T淋巴細(xì)胞的比例分別 為（56.4±5.2）﹪、（38.4±5.4）﹪、（60.7±7.7）﹪（F=46.486,P=0.000）；CD4+CD8-T 淋 巴細(xì)胞比例分別為（0.7±0.2）﹪、（1.1±0.2）﹪、（1.2±0.7）﹪（F=6.820,P=0.004）；CD4-CD8+T淋巴細(xì)胞比例分別為（17.8±5.1）﹪、（24.4±8.2）﹪、（10.3±3.7）﹪（F=9.069，P=0.001）.而其余時(shí)間各組間各類T淋巴細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 胸腺腎移植組術(shù)后2周及8周大鼠左右胸腺腎情況，圖a為術(shù)后2周大鼠左胸腺腎；圖b為術(shù)后2周大鼠右胸腺腎；圖c為術(shù)后8周大鼠左胸腺腎；圖d為術(shù)后大鼠右胸腺腎

圖2 胸腺腎移植組術(shù)后2周及8周胸腺腎組織學(xué)檢查情況，圖a為術(shù)后2周大鼠胸腺腎組織（HE染色×50）；圖b為術(shù)后2周大鼠胸腺腎組織（HE染色×200）；圖c為術(shù)后8周大鼠胸腺腎組織（HE染色×50倍）；圖d為術(shù)后8周大鼠胸腺腎組織（HE染色×200）

圖3 圖a為術(shù)后16周大鼠胸腺腎（×10）；圖b為術(shù)后16周大鼠胸腺腎組織（HE染色×50）；圖c為術(shù)后16周大鼠胸腺腎組織（HE染色×200倍）；圖d為術(shù)后16周大鼠胸腺腎組織（HE染色×400）

表1 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC中CD4-CD8- T淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

表1 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC中CD4-CD8- T淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細(xì)胞

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 39.0±11.540.1±9.845.5±14.849.1± 7.247.5±8.051.1±7.047.3± 9.8 - 56.4±5.262.1±6.6Ⅱ 15 38.6±10.342.8±9.646.6±12.843.2±10.847.1±8.048.3±4.045.5±11.1 - 38.4±5.4 -Ⅲ 5 46.8± 8.748.6±8.338.0± 6.736.6± 5.8 - - - - - -Ⅳ 5 39.0±11.540.1±9.845.5±14.849.1± 7.247.5±8.051.0±7.047.3± 9.854.0±5.360.7±7.7 -F值 0.808 1.041 0.549 2.970 0.010 0.925 0.118 46.486 P值 0.498 0.388 0.652 0.046 0.990 0.408 0.889 0.000

表2 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC中CD4+CD8- T淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

表2 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC中CD4+CD8- T淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細(xì)胞

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 28.4±8.833.5±8.929.0± 8.626.5± 5.825.2±7.026.2±4.128.5±6.5 - 25.1± 3.123.3±1.1Ⅱ 15 31.2±8.238.4±5.332.5± 7.428.7± 9.833.4±2.831.4±6.934.6±8.3 - 36.3±13.4 -Ⅲ 5 36.9±6.032.6±4.137.6±11.039.1±10.4 - - - - - -Ⅳ 5 28.4±8.833.5±8.929.0± 8.626.5± 5.825.2±7.026.2±4.128.5±6.530.0±1.528.0± 3.8 -F值 1.371 1.571 1.423 2.976 9.197 3.401 2.690 4.781 P值 0.269 0.215 0.254 0.046 0.001 0.047 0.085 0.016

表3 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC中CD4-CD8+ T 淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

表3 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC中CD4-CD8+ T 淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細(xì)胞，

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 31.5±17.025.4±12.724.4±13.023.2±10.027.5±13.022.1±6.023.0±5.9 - 17.8±5.1 14.0±5.2Ⅱ 15 29.0± 8.617.1± 7.019.3±11.226.8±20.117.5± 7.519.4±8.818.9±8.0 - 24.4±8.2 -Ⅲ 5 14.7± 2.616.9± 4.422.7± 5.622.4± 5.8 - - - - - -Ⅳ 5 31.5±17.025.4±12.724.4±13.023.2±10.027.5±13.022.1±6.023.0±5.914.3±4.410.3±3.7 -F值 2.254 2.215 0.521 0.196 3.478 0.519 1.370 9.069 P值 0.100 0.105 0.671 0.898 0.044 0.601 0.270 0.001

表4 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC 中 CD4+ CD8+ T 淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

表4 術(shù)后不同時(shí)間各組大鼠PBMC 中 CD4+ CD8+ T 淋巴細(xì)胞比例的變化（﹪，）

注：PBMC為外周血單核細(xì)胞

組別例數(shù) 0周 1周 2周 3周 4周 6周 8周 10周 12周 16周Ⅰ 12 1.1±0.4 1.1±0.4 1.1±0.7 1.2±1.4 1.0±0.7 0.7±0.2 1.2±0.8 - 0.7±0.2 0.6±0.4Ⅱ 15 1.3±0.5 1.8±1.6 1.6±1.6 1.4±0.5 1.5±1.0 1.0±0.5 1.1±0.3 - 1.1±0.2 -Ⅲ 5 1.5±0.3 2.0±0.9 1.8±0.6 1.9±0.5 - - - - - -Ⅳ 5 1.1±0.4 1.1±0.4 1.1±0.7 1.2±1.4 1.0±0.7 0.7±0.2 1.2±0.8 1.5±0.9 1.2±0.7 -F值 1.273 1.411 0.722 0.619 1.353 2.536 0.106 6.820 P值 0.300 0.257 0.546 0.608 0.274 0.097 0.899 0.004

圖4 圖a為去胸腺組和胸腺腎組術(shù)后6周出現(xiàn)明顯的分化，表現(xiàn)為去胸腺組CD4-CD8- T淋巴細(xì)胞比例仍持續(xù)上升，在第8周加去脾臟組中升高得更明顯，而胸腺腎組6周后開始逐漸下降；圖b,d為去胸腺組成熟的單陽性（CD4+ T和CD8+ T）淋巴細(xì)胞在術(shù)后6周后繼續(xù)下降，而胸腺腎組開始回升；圖c為去胸腺組CD4+CD8+ T淋巴細(xì)胞在術(shù)后6周后仍有波動，后續(xù)的檢測顯示呈低水平，而胸腺腎組6周后較平穩(wěn)

討 論

成功誘導(dǎo)特異性免疫耐受是解決器官移植免疫排斥的理想方法，近年來，胸腺移植對器官移植免疫耐受的誘導(dǎo)作用引起人們的重視，研究顯示帶血管的胸腺移植比胸腺細(xì)胞或胸腺組織塊移植有更好的誘導(dǎo)免疫耐受作用，原因在于胸腺組織移植時(shí)在胸腺血供得到重建前有一個(gè)缺血期，導(dǎo)致移植胸腺損傷，還致敏了受體。而血管化的胸腺避免了這一時(shí)期，因此明顯改善了誘導(dǎo)免疫耐受的效果。本文首次報(bào)道了用大鼠構(gòu)建胸腺腎以使胸腺血管化，并在行胸腺腎移植以前對移植胸腺的功能做了評估。該模型在免疫耐受研究領(lǐng)域有以下優(yōu)越性和應(yīng)用前景：(1)大鼠腎移植模型已很成熟，應(yīng)用廣泛，一人操作，研究成本和要求比小型豬低；(2)已有的胸腺腎研究側(cè)重于研究胸腺移植后誘導(dǎo)免疫耐受的效果，本模型在移植前進(jìn)行胸腺功能評估，顯示大鼠胸腺腎移植時(shí)間應(yīng)選在胸腺腎構(gòu)建后6周左右，不用像小型豬需等到術(shù)后2～3個(gè)月[7-9]，3～4個(gè)月后大鼠胸腺腎中的胸腺已開始退化；(3)評估胸腺功能的經(jīng)典辦法是選擇在SCID小鼠或裸小鼠中進(jìn)行胸腺移植[17]，本模型在去胸腺大鼠中進(jìn)行胸腺功能評估，更能為下一步大鼠胸腺腎移植提供直接指導(dǎo)意義；(4)有學(xué)者報(bào)道了在大鼠體內(nèi)行帶血管的胸腺移植[18]，如果同時(shí)行其他器官移植，也達(dá)到了胸腺移植誘導(dǎo)免疫耐受時(shí)移植胸腺的同步血管化，但在大鼠這種小動物身上操作較難，要求高，不利于應(yīng)用，本模型避免了這一缺點(diǎn)；(5)腎包膜局部血液供給豐富，手術(shù)操作簡單，移植物的變化（增生、萎縮、吸收、退化或排斥）易于通過手術(shù)開腹直接觀察，移植物也可便利地切取進(jìn)行各種組織學(xué)檢查。

本研究對照組術(shù)后早期雙陽性T細(xì)胞在術(shù)后早期比例較高，考慮是由于正常功能的胸腺因?yàn)槭中g(shù)應(yīng)激加強(qiáng)了對雙陰性T淋巴細(xì)胞成熟發(fā)育的結(jié)果。去胸腺后3周內(nèi)，CD4+T淋巴細(xì)胞先上升后回降，CD8+T淋巴細(xì)胞先下降后回升，這種變化考慮是由手術(shù)應(yīng)激引起，是淋巴細(xì)胞對手術(shù)打擊的一種正常反應(yīng)。在Ⅰ組中第8周加去脾臟組中也發(fā)現(xiàn)8周后的一段時(shí)間內(nèi)成熟的單陽性T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)類似變化也證實(shí)了這一點(diǎn)，只是這種反應(yīng)沒有第一次手術(shù)時(shí)反應(yīng)明顯，顯示出成熟淋巴細(xì)胞在沒有胸腺的情況下數(shù)量上仍然能對外界刺激作出一定反應(yīng)，由此推測在沒有胸腺支持新生T淋巴細(xì)胞發(fā)育的情況下，定居在其它淋巴組織中的成熟T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)對PBMC中成熟T淋巴細(xì)胞數(shù)量的維持發(fā)揮了重要作用，在大鼠去胸腺后隨訪到16周也沒見到單陽性T淋巴細(xì)胞下降到0，在加去脾臟后（脾臟是成熟T淋巴細(xì)胞定居的重要場所之一），雙陰性細(xì)胞進(jìn)一步上升，單陽性細(xì)胞繼續(xù)下降也證實(shí)了這一點(diǎn)。在選取對照組時(shí)，大鼠年齡偏?。?0～100 g），這樣降低了和實(shí)驗(yàn)組的可比性，但從中也發(fā)現(xiàn)，未成年期大鼠（< 100 g）CD4+/CD8+比值大于成年大鼠（150～250 g），導(dǎo)致線圖的起始值相差較遠(yuǎn)，有文獻(xiàn)顯示正常大鼠CD4+/CD8+比值約為4:1，測定的結(jié)果沒有這么高，這可能與部分大鼠在胸腺腎構(gòu)建完成關(guān)腹后取血有關(guān)，手術(shù)應(yīng)激后導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞升高。因?yàn)榭紤]到可比性降低，所以假手術(shù)組在4周后未再行流式檢測。線圖中Ⅰ、Ⅱ組在第10周的斷點(diǎn)是由實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)造成，該時(shí)間點(diǎn)未檢測造成數(shù)值缺失。Ⅳ組加測第10周是為了更詳細(xì)了解去脾臟的影響。去脾臟組證實(shí)了在阻斷胸腺選擇發(fā)育新生T淋巴細(xì)胞的情況下，外周成熟T細(xì)胞的擴(kuò)增對PBMC中成熟T淋巴細(xì)胞數(shù)量的維持發(fā)揮了重要作用。

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