基于Plackett-Burman設(shè)計的刺糖多孢菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

沈秀軍，劉 柳，高 亮，黃訓端

（安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥230601）

多殺菌素是新型生物源農(nóng)藥，殺蟲效果高度專一，能有效地控制鱗翅目、雙翅目、纓翅目、鞘翅目和直翅目等作物害蟲，對昆蟲天敵、哺乳動物和水生生物低毒或無毒，可光降解或微生物分解，環(huán)境友好［1-7］。多殺菌素類農(nóng)藥通過美國環(huán)保局的注冊和農(nóng)業(yè)部有機農(nóng)業(yè)使用認證準許，獲得了美國“總統(tǒng)綠色化學品挑戰(zhàn)獎”［1］。目前，世界上已有多個國家批準使用該類農(nóng)藥，我國多殺菌素類產(chǎn)品主要依賴進口。

刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）是多殺菌素的生產(chǎn)菌。為加快多殺菌素的開發(fā)利用，科技人員主要做了兩方面工作：第一是刺糖多孢菌菌株選育，主要側(cè)重于多殺菌素的高產(chǎn)性、穩(wěn)定性等方面［8］；第二是刺糖多孢菌生長特性及發(fā)酵技術(shù)研究，優(yōu)化與研究刺糖多孢菌培養(yǎng)條件，是提高發(fā)酵水平的重要途徑。國內(nèi)外學者相繼開展了大量發(fā)酵研究工作［9-11］，但刺糖多孢菌為好氧生物，培養(yǎng)過程復雜，影響因素多，條件參數(shù)可重復性差，需進一步優(yōu)化處理。

實驗優(yōu)化方法較多，Plackett-Burman設(shè)計是最具優(yōu)勢的方法之一。Plackett-Burman設(shè)計針對因子數(shù)較多、不能判定各個因子作用情況下，選取若干影響因子，通過分析各因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，為優(yōu)化實驗提供依據(jù)。Plackett-Burman設(shè)計高效、實用，已廣泛應(yīng)用于生物學過程研究中［12-13］。本研究通過Plackett-Burman設(shè)計，優(yōu)化刺糖多孢菌培養(yǎng)條件，為進一步提高多殺菌素產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

刺糖多孢菌，本實驗室保藏菌種。

1.2 儀器設(shè)備

全溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超凈工作臺（SCV-4A1），新加坡ESCO公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；離心機；電子分析天平。

1.3 培養(yǎng)基

種子 培 養(yǎng) 基 （g／L）：可 溶 淀 粉 20.0，葡 萄 糖10.0，牛肉膏蛋白胨30.0，酵母提取物3.0，MgSO4·7H2O 2.0，KH2PO41.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖40.0，牛肉膏蛋白胨 15.0，NaCl 3.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 2.0。以上培養(yǎng)基配好后，于121℃濕熱滅菌30min，備用。

1.4 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)方法：將刺糖多孢菌從斜面取適量接種到種子培養(yǎng)基中，30℃條件下，搖床轉(zhuǎn)速240r／min培養(yǎng)至一定菌液濃度，備用。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法：在裝有培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，按一定比例接種菌種，在一定溫度條件下振蕩培養(yǎng)一定時間，測定其生物量。

1.5 生物量測定

采用菌體干重測定法。取10mL培養(yǎng)液于離心管中，3 500r／min離心15min，棄去上清液，將菌體置于105℃下干燥至恒重，稱量計算刺糖多孢菌生物量。

1.6 實驗設(shè)計方法

1.6.1 單因素實驗

刺糖多孢菌發(fā)酵實驗在250mL三角瓶中進行，由于影響微生物生長因素很多，在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)基初始pH值、接種量、玻璃珠數(shù)、溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速、時間等7個因素，考查各因素對生物量的影響。各種因子設(shè)置梯度為：初始pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；接種量0.5%、1%、2%、3%、4%；玻璃珠個數(shù)1個、5個、10個、15個、20個；溫度24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；裝液量20 mL、30mL、40mL、50mL；轉(zhuǎn)速160r／min、200r／min、240r／min、280r／min、320r／min；時間為36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144 h、156h、168h。

1.6.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計

對初始pH值、接種量、玻璃珠數(shù)、培養(yǎng)溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速、時間等7因子分別編碼（表1），為滿足實驗誤差分析需要，設(shè)置4個因子虛擬項，每個因子設(shè)置2個水平，高水平賦值為1，低水平賦-1，實驗以刺糖多孢菌生物量為響應(yīng)值（Y），采用 Design Expert軟件進行實驗設(shè)計（表2），共12組實驗。

表1 實驗因素水平及編碼代碼

1.7 數(shù)據(jù)處理

以Design Expert（version 8.0.7.1）為工具，進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基初始pH值對刺糖多孢菌生物量的影響

每種微生物有其適宜的pH范圍，培養(yǎng)基初始pH值是接種后微生物生長繁殖的重要環(huán)境因子，影響微生物的生物量。刺糖多孢菌的生長與初始pH值關(guān)系見圖1。從圖1顯示刺糖多孢菌在初始pH值6.5～7.5的范圍內(nèi)能較好生長，在初始pH值為7時，生物量最大，達到8.23g／L。

圖1 初始pH值與刺糖多孢菌生物量的關(guān)系

2.2 接種量對刺糖多孢菌生物量的影響

將刺糖多孢菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液濃度為1×108CFU／mL，按比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量對多殺菌素生產(chǎn)菌生物量的產(chǎn)生了影響（圖2），隨接種量的增加，生物量呈遞增趨勢，但隨著接種量的進一步增大，生物量下降。接種量大小與菌株在發(fā)酵過程中的生長繁殖速度有關(guān)。但是過大的接種量往往使菌體生長過快、過稠，造成營養(yǎng)基質(zhì)缺乏或溶解氧不足而不利于發(fā)酵；接種量過小，則會引起發(fā)酵前期菌體生長緩慢，使發(fā)酵周期延長，還可能產(chǎn)生菌絲團，導致發(fā)酵異常等。圖2表明，接種量在1%～4%之間較為適宜，以2%為最佳。

圖2 接種量與刺糖多孢菌生物量的關(guān)系

2.3 添加玻璃珠個數(shù)對刺糖多孢菌生物量的影響

在培養(yǎng)基中添加玻璃珠，具有維持液體培養(yǎng)基溶氧和分散菌體的作用。由圖3可知，在250mL三角瓶中，玻璃珠數(shù)量在5～20個范圍內(nèi)較為合適，其中以15個最佳，玻璃珠數(shù)量過多時，雖然溶氧條件改善，但液體的剪切力最加，有可能引起菌體損傷，或細胞死亡。

圖3 添加玻璃珠數(shù)量與刺糖多孢菌生物量的關(guān)系

2.4 溫度對對刺糖多孢菌生物量的影響

培養(yǎng)溫度是微生物生長繁殖的關(guān)鍵環(huán)境因子。圖4表明刺糖多孢菌生物量與培養(yǎng)溫度呈先增后降的變化規(guī)律。當培養(yǎng)溫度小于30℃時，溫度與生物量呈同向遞增的關(guān)系；大于30℃，溫度與生物量呈反向遞減關(guān)系。刺糖多孢菌的最適宜溫度為30℃。

圖4 培養(yǎng)溫度與刺糖多孢菌生物量的關(guān)系

2.5 搖瓶裝液量對刺糖多孢菌生物量的影響

搖瓶裝液量與微生物生長中需氧量、微生物分散度都有一定關(guān)系。在250mL三角瓶中，搖瓶裝液量對多殺菌素生產(chǎn)菌生物量的影響見圖5。從圖5可以看出，30mL時生物量最大，當裝液量大于30時，隨著裝液量的增加，發(fā)酵單位呈顯著下降趨勢。

圖5 搖瓶裝液量與刺糖多孢菌生物量的關(guān)系

2.6 搖瓶轉(zhuǎn)速對刺糖多孢菌生物量的影響

振蕩培養(yǎng)也與液態(tài)培養(yǎng)基溶氧、菌體分散、振蕩剪切力有關(guān)。在250mL三角瓶中，考查了轉(zhuǎn)速范圍160～320r／min，對多殺菌素生產(chǎn)菌生物量的影響（圖6）。結(jié)果表明在200～320r／min轉(zhuǎn)速條件下，生長良好，其中以240r／min最佳。

圖6 搖瓶轉(zhuǎn)速與刺糖多孢菌生物量的關(guān)系

2.7 培養(yǎng)時間對刺糖多孢菌生物量的影響

培養(yǎng)時間與刺糖多孢菌生物量關(guān)系密切（圖7），在培養(yǎng)時間72～156h范圍內(nèi)菌體生物量較大，其中培養(yǎng)時間96～120h生物量最大。圖7也反映了該菌的生長特性，培養(yǎng)時間在36～84h時處于對數(shù)期，生長迅速；84～144h時處于穩(wěn)定期；144h以后進入衰亡期。

圖7 培養(yǎng)時間與多殺菌素生產(chǎn)菌生物量的關(guān)系

2.8 刺糖多孢菌培養(yǎng)條件Plackett-Burman分析與優(yōu)化

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計要求，開展了12組實驗，通過搖瓶實驗、生物量的測量，獲得了實驗響應(yīng)值Y，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。從響應(yīng)值來看，刺糖多孢菌生物量范圍從5.90g／L到8.98g／L，不同實驗條件下，響應(yīng)值存在差異。

在Design Expert軟件輔助下，對Plackett-Burman實驗結(jié)果進行分析，回歸模型方差分析見表3。表3表明，回歸模型的P值小于0.01，模型極顯著，模型的決定系數(shù)R2為0.9767，調(diào)整決定系數(shù)R2為0.9359，說明回歸模型可以解釋93.59%的響應(yīng)值變化，模型的擬合度高。系數(shù)顯著檢驗結(jié)果顯示，初始pH 值（x1）、培養(yǎng)溫度（x5）、裝液量（x7）、轉(zhuǎn)速（x8），達到極顯著或顯著水平。

表2 Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析表

回歸系數(shù)估計及因子貢獻率見表4。在本實驗設(shè)計條件下，7個因子的重要性排序為：初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量、玻璃珠數(shù)、接種量、時間。從貢獻度來分析，前4個因子對響應(yīng)值的影響貢獻率總和達90.8%，其中初始pH值貢獻率為55.23%、培養(yǎng)溫度為24.45%，兩者為重中之重。由此，可以確定初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量為刺糖多孢菌發(fā)酵條件的注效因子。

根據(jù)表4，建立回歸方程：Y＝7.73-0.63x1-0.14x2＋0.17x4＋0.42x5-0.20x7＋0.20x8＋0.021x10。為重點考慮主效因子的作用，將回歸模型修正 為：Y ＝7.73-0.63x1＋0.42x5-0.20x7＋0.20x8。利用該模型，預測刺糖多孢菌的最大生物量可達9.18g／L。

表4 回歸系數(shù)估計及因子貢獻率分析

3 結(jié)論

在單因子實驗基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman實驗設(shè)計，建立刺糖多孢菌生物量回歸模型：Y＝7.73-0.63x1＋0.42x5-0.20x7＋0.20x8，模型顯著，快速篩選出初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量為顯著性影響因子，4因子對響應(yīng)值變化的影響達90.8%，為進一步開發(fā)刺糖多孢菌發(fā)酵技術(shù)提供了參考。

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