酵母天然自溶促進(jìn)劑篩選

王東明，應(yīng)俊輝，孔秋燕，王燕飛，林思思

（麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程分院，浙江 麗水 323000）

目前生產(chǎn)酵母抽提物的方法主要有自溶法、酶分解法和酸分解法等3種，歐美及我國(guó)所生產(chǎn)的酵母抽提物絕大部分都是采用這種方法。自溶促進(jìn)劑可以加速酵母的自溶，縮短自溶時(shí)間，自溶促進(jìn)劑包含有：食鹽、乙醇、甲苯、乙酸、乙醇、半胱氨酸、吡哆醇、硫胺素、碳原子數(shù)為4～14的脂肪酸及其甘油脂、氨基乙醇、EDTA等，其中研究最早且最多的是食鹽和乙醇，但這2種物質(zhì)一般加量較大時(shí)才能有明顯的促進(jìn)作用，這樣在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)造成一些負(fù)面影響，如食鹽含量很高，因而須進(jìn)行脫鹽處理，而當(dāng)乙醇加量過(guò)高時(shí)，也會(huì)不利于反應(yīng)的進(jìn)行[1]。我國(guó)有豐富的啤酒酵母資源，以其生產(chǎn)酵母抽提物不僅合理地利用了啤酒廠的下腳料，具有顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、環(huán)保效益[2]。本研究篩選天然抗酵母物質(zhì)，開(kāi)發(fā)酵母天然自溶促進(jìn)劑，為工業(yè)化生產(chǎn)酵母抽提物提供安全無(wú)毒天然促進(jìn)劑，并能改善抽提物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料

黃芩、七葉一枝花、蒼耳子、梔子，黃柏、大麻仁、桑葉、板藍(lán)根、薏仁、茯苓、蒲公英、半邊蓮、杏仁、金銀花、桔梗、夏枯草、紫花地丁、八角茴香、冬瓜仁、香薷、決明子，田基黃、大青葉、防己、白花蛇王草、小春花、千里光、蒼耳、秦皮、黃連、牛蒡子、陳皮、大黃、黨參、甘草、吳茱萸、槐米，從麗水市百姓大藥房購(gòu)買(mǎi)。

1.1.2 菌種

安琪高活性酵母菌。

1.1.3 試劑

茚三酮、亮氨酸、抗壞血酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、美藍(lán)等。

1.1.4 培養(yǎng)基

馬鈴薯固體培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基[3]。

2 方法

2.1 抗酵母物質(zhì)篩選

1）植物材料洗凈后，80℃烘干，碾碎，稱(chēng)取樣品5 g～6 g于錐形瓶中，加入乙醇20 mL～30 mL，浸泡24 h，過(guò)濾后，濃縮至浸膏狀[4]。

2）吸取200μL酵母菌菌懸液于馬鈴薯固體培養(yǎng)基平板上，用三角涂棒涂勻。將無(wú)菌濾紙片（直徑1 cm）蘸取植物提取液濃縮浸膏平鋪在含菌平板中，每個(gè)平板放置4塊濾紙片[3]。

2.2 抗菌物質(zhì)促酵母自溶效果

1）稱(chēng)七葉一枝花、桔梗、牛蒡子、八角茴香、秦皮各10 g，分別放入150 mL三角瓶，加水20 mL，封口膜密封，80℃下水浴5 h，過(guò)濾，制備中藥材水提液，放入冰箱低溫保藏備用。

2）稱(chēng)取酵母5 g加入150 mL三角瓶，分別加入七葉一枝花、桔梗、牛蒡子、八角茴香、秦皮水提液1 mL，以不加藥液做對(duì)照，調(diào)節(jié)至pH7.0，定容到50 mL，封口膜密封，50℃下水浴24 h，過(guò)濾，美藍(lán)染色，鏡檢觀察酵母細(xì)胞[3]。取濾液測(cè)定可溶性蛋白、游離氨基酸含量。

3）稱(chēng)取酵母5 g加入150 mL三角瓶，分別加入桔梗、八角茴香水提液0.5、1、0.5、1.5、2、2.5 mL，方法同1.2.2中2）。

4）考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量，茚三酮法測(cè)定游離氨基酸含量[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗酵母物質(zhì)篩選

抗酵母物質(zhì)篩選如圖1。

30多種植物材料中，桔梗、八角茴香、七葉一枝花、大黃、牛蒡子、秦皮6種對(duì)酵母菌具有抗菌效果，其中以七葉一枝花、桔梗的抗菌效果最明顯，說(shuō)明從天然植物材料中比較容易篩選出抗酵母菌物質(zhì)。桔梗嫩莖葉和根均可供蔬食，盛產(chǎn)于我國(guó)東北部地區(qū)，是朝鮮族的特色菜；八角茴香是屬于既是藥品又是食品的品種；牛蒡子屬于衛(wèi)生部批準(zhǔn)可用于保健食品的物品[6]，大黃有一定致瀉作用；桔梗、八角茴香、牛蒡子等適合做酵母天然自溶促進(jìn)劑。

圖1 不同抗菌植物材料抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different plant materials

黃芩、槐米、香薷、紫花地丁等主要含黃酮類(lèi)化合物，吳茱萸、小春花、半邊蓮、大麻仁、黃柏、防己、黃連等主要含生物堿，金銀花、蒲公英主要含有機(jī)酸，上述植物材料所含的活性成分對(duì)酵母菌不具有抗菌效果；陳皮、杏仁、八角茴香主要含有揮發(fā)油，牛蒡子主要含木脂素，秦皮主要含香豆素，大黃、決明子主要含蒽醌類(lèi)化合物，茯苓、夏枯草、七葉一枝花、田基黃、梔子、黨參、甘草、蒼耳子、桔梗、蒼耳、千里光等主要含萜類(lèi)化合物，由于植物材料中活性成分種類(lèi)多樣性，同一類(lèi)成分中某幾種結(jié)構(gòu)類(lèi)型才有抗菌效果，需要進(jìn)一步深入研究，才能精確定位到是那類(lèi)結(jié)構(gòu)類(lèi)型化合物產(chǎn)生抑菌作用。

2.2 抗菌植物材料促自溶效果分析

抗菌植物材料促自溶效果分析如圖2。

圖2 不同抗菌植物材料促進(jìn)酵母自溶效果Fig.2 Effect of accelerating yeast autolysis of different plant Materials

酵母細(xì)胞50℃下水浴24 h，美藍(lán)染色，鏡檢觀察，在有無(wú)抗菌物質(zhì)的情況下，菌體細(xì)胞呈藍(lán)色，說(shuō)明酵母細(xì)胞衰退或死亡。酵母屬于中溫性菌，50℃下水浴，酵母得不到充足氧氣和養(yǎng)分，蛋白質(zhì)變性等，菌體正常代謝被破壞?？扇苄缘鞍资怯删w滲透出來(lái)的水溶性蛋白，測(cè)定可溶性蛋白可反映出菌體蛋白降解及菌體自溶狀況。加入抗菌物質(zhì)后，可溶性蛋白含量明顯提高，說(shuō)明抗菌物質(zhì)能作用于菌體代謝系統(tǒng)，促進(jìn)菌體蛋白降解為水溶性蛋白，并提高菌體破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)酶的活性，造成菌體結(jié)構(gòu)破壞，滲透性增強(qiáng)，其中以加入桔梗的效果最明顯，秦皮效果最?。挥坞x氨基氮含量反映酵母菌體的內(nèi)源性蛋白酶將菌體蛋白質(zhì)完全水解成氨基酸而溶解出菌體外的過(guò)程，酵母水浴液中加入七葉一枝花，游離氨基氮含量明顯下降；加入其他抗菌物質(zhì)后，游離氨基氮含量均在0.03 mg/mL左右水平，僅八角茴香能略微提高游離氨基氮含量，說(shuō)明抗菌物質(zhì)對(duì)將蛋白質(zhì)完全水解成氨基酸的相關(guān)蛋白酶活性作用小，七葉一枝花尚有一定抑制作用。

桔梗提高可溶性蛋白含量最明顯，八角茴香能略微提高游離氨基氮含量，兩者藥食兼用，適合作為酵母天然自溶促進(jìn)劑。乙醇濃縮液以七葉一枝花抗菌效果最明顯，水提液以桔梗和八角茴香促自溶效果理想，平板抑菌試驗(yàn)中抗菌物質(zhì)作用于增殖狀態(tài)的菌體，水浴液中抗菌物質(zhì)作用靜止?fàn)顟B(tài)的菌體，抗性上有一定差異；抗菌物質(zhì)抗菌性能變化與抗菌物質(zhì)溶解度也有一定關(guān)系，乙醇溶解范圍廣，能溶解親脂性成分和親水溶性成分，七葉一枝花中抗菌活性成分可能主要為極性小的成分。酵母自溶法是在水中進(jìn)行，應(yīng)提高天然抗性物質(zhì)在水中的溶解度或選擇水溶性大的物質(zhì)。

2.3 桔梗和八角茴香促自溶效果分析

桔梗和八角茴香促自溶效果分析如圖3。

酵母水浴液中加入八角茴香，可溶性蛋白含量隨著八角茴香水提液用量增加而增加，當(dāng)八角茴香水提液大于1.5 mL，可溶性蛋白含量下降，說(shuō)明八角茴香用量少時(shí)，能提高將蛋白質(zhì)部分水解的相關(guān)蛋白酶活性，提高菌體破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)酶的活性，當(dāng)八角茴香用量大時(shí)，又會(huì)產(chǎn)生一定抑制作用。八角茴香水提液對(duì)游離氨基氮含量影響不大，說(shuō)明八角茴香對(duì)將蛋白質(zhì)完全水解成氨基酸的相關(guān)蛋白酶活性影響小。

桔梗水提液提高可溶性蛋白含量，但不隨桔梗使用量而發(fā)生改變，說(shuō)明桔梗的活性成分對(duì)菌體部分水解蛋白酶活性及細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞相關(guān)酶活性的激活作用達(dá)到飽和。桔梗用量超過(guò)2 mL，游離氨基氮含量下降，說(shuō)明桔梗用量大時(shí)會(huì)對(duì)將蛋白質(zhì)完全水解成氨基酸的相關(guān)蛋白酶產(chǎn)生抑制作用。

圖3 桔梗和八角茴香促自溶效果Fig.3 Effect of accelerating yeast autolysis of Radix Platycodonis,Illicium verum

3 結(jié)論

30多種植物材料中，桔梗、八角茴香、七葉一枝花、大黃、牛蒡子、秦皮6種對(duì)酵母菌具有抗菌效果，酵母50℃水浴液中加入抗菌物質(zhì)，可溶性蛋白含量含量增加，說(shuō)明抗菌物質(zhì)促進(jìn)菌體蛋白降解為水溶性蛋白，并對(duì)酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，能促進(jìn)酵母自溶，適合作為酵母天然自溶促進(jìn)劑，但對(duì)將蛋白質(zhì)完全水解成氨基酸的相關(guān)蛋白酶作用小，七葉一枝花還有一定抑制作用。桔梗、八角茴香藥食兼用，作為酵母天然自溶促進(jìn)劑，還具有改善風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值作用，如果應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，許多細(xì)節(jié)問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

[1]郭永,龐宏建.酵母抽提物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品,2010(12):24-28

[2]秦楠,繆文玉.酵母抽提物生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用現(xiàn)狀[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2009(12):27-29

[3]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,1999：42,100-102,215

[4]董小萍.中藥品種與化學(xué)成分實(shí)驗(yàn)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2003:168-173

[5]劉永軍,郭守華,楊曉玲.植物生理生化實(shí)驗(yàn)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2002:64-66,81-82

[6]衛(wèi)生部.衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知[EB/OL].（2002-02-28） http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdjdJ/s3593/200810/38057.htm