鳳眼蓮總黃酮微波提取工藝的研究

戶 勛，余 萍，張 慾

(1．福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002;2．福建師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，福建福州350007;3．福建農(nóng)林大學(xué)計算機(jī)與信息學(xué)院，福建福州350002)

鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)屬雨久花科，鳳眼蓮屬，多年生宿根浮水草本植物(Kathiresan，2000)。因其在根與葉之間有一個個像葫蘆狀的大氣泡又稱水葫蘆，又名布袋蓮、水浮蓮、水荷花、假水仙，為漂浮生惡性雜草(Holms et al，1977)。水葫蘆原產(chǎn)于南美，19世紀(jì)期間引入東南亞，1901年作為花卉引入中國(刁正俗，1990)。20世紀(jì)30年代，水葫蘆作為畜禽飼料由臺灣引入中國大陸，并作為觀賞和凈化水質(zhì)的植物在中國南方各省推廣種植，后逃逸為野生(丁建清，1995)，并已擴(kuò)散到溫帶地區(qū)，成為我國淡水水體中主要的外來入侵物種之一。鳳眼蓮主要在中國南方分布，由于北方河流有凍結(jié)期，鳳眼蓮無法在自然狀態(tài)下生存。但近年來，隨著全球變暖和它的自然選擇進(jìn)化，其危害區(qū)有向北拓展的趨勢。

天然黃酮類化合物是植物體中多酚類的內(nèi)信號分子及中間體或代謝物。由于黃酮類化合物廣泛分布于植物中，其生理活性多種多樣，引起了國內(nèi)外廣泛注意，研究進(jìn)展很快。目前從天然產(chǎn)物中分離到并確定的黃酮數(shù)目達(dá)8000多種。大量研究證明:黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗過敏、抗糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性及藥理作用，且無毒無害，對人類的腫瘤、衰老、心血管病等疾病的治療和預(yù)防有重要的意義。此外，還可用作食品、化妝品的天然添加劑、如甜味劑、抗氧化劑、食用色素等。因此，成為近幾年研究、開發(fā)、利用的熱點，其在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景(屠鵬飛等，1996;陳維杻，1998;丁利君等，2002)。

黃酮類化合物的提取通常采用水提取和極性溶劑提取兩種方法(Hu and Skibsted，2002)。極性溶劑易滲入至原料的內(nèi)部，提取效果要好于水提取法。極性溶劑中，乙醇的食用安全性高，價格較低，可回收再利用。本文選定乙醇作為鳳眼蓮總黃酮的提取溶劑(李彩俠等，2006)，采用微波法(王娟等，2002;范志剛等，2000)從鳳眼蓮干粉中提取總黃酮。因目前天然產(chǎn)物總黃酮的提取對熱水浸提法和超聲波法報道較多，而微波法方面的資料極少。因此本研究決定在微波法的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，進(jìn)一步探討微波法提取總黃酮的最佳提取條件。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)取自福建農(nóng)林大學(xué)池塘。

1．2 試驗方法

1．2．1 原料預(yù)處理 將鳳眼蓮整株去根、去腐敗和枯黃部分后洗凈曬干，用剪刀絞成小段后置于烘箱烘干，然后粉碎，再置于烘箱烘干，保存于干燥器中備用。

1．2．2 微波法提取鳳眼蓮總黃酮的工藝流程

1．2．3 微波法提取鳳眼蓮總黃酮的單因素試驗 準(zhǔn)確稱取若干鳳眼蓮干粉于微波爐用碗(帶蓋)中，加入乙醇溶液，微波處理，抽濾定容，作為待測液。此項試驗分別以不同的乙醇濃度、微波時間、料液比、微波火力為單因素進(jìn)行。

1．2．4 鳳眼蓮待測液中總黃酮含量的測定

(1)分析方法與原理

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定總黃酮的含量。黃酮類化合物中含有堿性氧原子，一般又多帶酚性羥基，能與金屬鹽類試劑如鋁鹽、鉛鹽、鎂鹽和鐵鹽等形成顏色較深的絡(luò)合物，在一定波長下有最大吸收峰，在此波長下可以進(jìn)行比色分析。加入的NaNO2起還原劑作用，防止黃酮類化合物受氧化而損失。

(2)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液最大波長的選擇

分別準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的蘆丁10 mg、15 mg、20 mg，用30%的乙醇溶解完全并定容于100 mL容量瓶中，搖勻得濃度分別為0．1 mg/mL、0．15 mg/mL、0．2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 mL于50 mL容量瓶中，用30%乙醇補(bǔ)充至20 mL，加入 NaNO2(1:20)溶液 1．5 mL，搖勻，放置5 min 后加入 Al(NO3)3(1:10)溶液1．5 mL，搖勻，放置6 min后再加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10 min后于紫外分光光度計450-700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以空白試劑為參比，確定最大吸收波長λmax。

(3)乙醇提取液最大吸收波長的選擇

取制備好的乙醇提取液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0．1 mg/mL)各5mL分別置于2個50 mL容量瓶中，各加入30%乙醇溶液補(bǔ)充至20 mL，加入NaNO2(1:20)溶液1．5 mL，搖勻，放置5 min后加入Al(NO3)3(1:10)溶液1．5 mL，搖勻，放置6 min后再加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10 min后于波長510 nm處比色測定，參比為空白試劑。在450 nm-700 nm之間掃描其吸光度值，檢測吸光度峰值出現(xiàn)情況。

(4)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

準(zhǔn)確稱經(jīng)105℃干燥至恒重的蘆丁5．0 mg，用30%的乙醇溶解完全并定容于50 mL容量瓶中，搖勻得濃度為0．1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精取該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL放入7只50 mL容量瓶中，各加入30%乙醇溶液補(bǔ)充至20 mL，加入NaNO2(1:20)溶液 1．5 mL，搖勻，放置5 min 后加入 Al(NO3)3(1:10)溶液 1．5 mL，搖勻，放置6 min后再加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液，搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10 min后于波長510 nm處比色測定，參比為空白試劑。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C與吸光度A繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用二元線性回歸法求回歸方程。

(5)待測液中總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取5 mL鳳眼蓮總黃酮待測液置于50 mL容量瓶中，按上述方法測定其吸光度，由(4)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計算出總黃酮的質(zhì)量濃度C，再換算成鳳眼蓮干粉的總黃酮提取率e。

式中A為待測液定容量(mL)，B為吸取測定量(mL)，C為線性計算出的濃度，D為測定時定容量(mL)，E為稱量鳳眼蓮干粉量(g)。

1．2．5 微波法正交試驗 取1 g鳳眼蓮干粉，在微波法的單因素基礎(chǔ)上，進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗，以提取液中總黃酮的含量高低為考察指標(biāo)，確定鳳眼蓮干粉中總黃酮提取的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2．1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液最大波長

濃度為 0．1 mg/mL、0．15 mg/mL、0．2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng) NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法后的紫外吸收光譜見圖1。

從吸收光譜圖1中可以看出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長510 nm處具有最大吸光度，且吸收范圍較寬，與文獻(xiàn)報道一致，所以選擇吸收波長510 nm作為定量測定波長。

圖1 不同濃度溶液的吸收光譜Figure 1 The absorption spectrum of different concentration rutin

2．2 乙醇提取液最大吸收波長

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液制成顯色檢測液，檢測波長的掃描從波長700 nm開始，在510 nm處出現(xiàn)峰值，如圖2所示。乙醇提取液制成顯色檢測液，檢測波長的掃描從700 nm開始，在510 nm處出現(xiàn)峰值，如圖2所示。

結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和乙醇提取液制成顯色檢測液后最大吸收波長一致，均為510 nm，故確定510 nm為總黃酮顯色檢測液的測定波長。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與乙醇提取液顯色檢測液在可見光波長為450－700 nm之間掃描結(jié)果Figure 2 Results of scanning solution of sophorin standard preparation and sample at wavelength of 450-700 nm

2．3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C與吸光度A作圖，如圖3所示。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸得蘆丁濃度C(mg/mL)與吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式:A=0．00128+10．75625C，相關(guān)系數(shù)R=0．99968。表明本方法線性關(guān)系良好，可作為鳳眼蓮總黃酮含量的測定方法。

2．4 微波法單因素試驗并測定總黃酮含量

2．4．1 乙醇濃度對總黃酮提取的影響 分別準(zhǔn)確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇溶液40 mL，在中低火檔微波提取3 min。探討乙醇濃度對總黃酮提取的影響，結(jié)果如圖4所示。

總黃酮提取量在乙醇濃度為40%前上升較快，而后趨于平緩，并且當(dāng)乙醇濃度過高時，提取量下降明顯。這可能是因為乙醇濃度過高，在微波條件下易揮發(fā)失去，導(dǎo)致總黃酮溶出降低。40%與70%兩處總黃酮提取量都比較高，基于節(jié)約溶劑和環(huán)保，本試驗選擇40%的乙醇溶液。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Figure 3 The standard curve of rutin

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取的影響Figure 4 The influence of different density on extraction

2．4．2 微波時間對總黃酮提取的影響分別準(zhǔn)確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為40%的乙醇溶液40 mL，在中低火檔微波提取 1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。探討微波時間對總黃酮提取的影響，結(jié)果如圖5所示。

總黃酮的提取量總體上隨著時間的延長而升高，在4 min時提取量最大，時間再延長呈下降趨勢。這可能是由于微波時間太長引起溫度升高造成乙醇揮發(fā)，以及微波對總黃酮結(jié)構(gòu)破壞造成損失導(dǎo)致的，故以4 min為適宜微波時間。

圖5 微波時間對總黃酮提取的影響Figure 5 The influence of microwave time on extraction

2．4．3 料液比對總黃酮提取的影響 分別準(zhǔn)確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為40%的乙醇溶液 20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL，在中低火檔微波提取4 min。探討料液比對總黃酮提取的影響，結(jié)果如圖6所示。隨著乙醇溶液體積的增大，總黃酮的提取量呈明顯的上升趨勢，一直到1:80后才出現(xiàn)平緩的走向，基于節(jié)約溶劑和回收，本試驗選擇了1:80為適宜的料液比。

2．4．4 微波火力對總黃酮提取的影響 分別準(zhǔn)確稱取1．0 g鳳眼蓮干粉，加入體積濃度為40%的乙醇溶液40 mL，在低火、中低火、中火、中高火、高火檔微波提取4 min。探討微波火力對總黃酮提取的影響，結(jié)果如圖7所示。

可以看出，火力越高越不適宜總黃酮的提取，可能是由于溫度過高導(dǎo)致溶劑損失嚴(yán)重反而不利于總黃酮溶出等原因引起的，故選擇中低火較為適宜。

單因素試驗結(jié)果表明各單因素最適宜條件如下:微波時間4 min、乙醇濃度40%、料液比1:80、微波火力 M．Low。

圖6 料液比對總黃酮提取的影響Figure 6 The influence of solid and solution ratio on extraction

圖7 微波火力對總黃酮提取的影響Figure 7 The influence of microwave firepower on extraction

2．5 微波法正交試驗

2．5．1 正交試驗 綜合微波法單因素試驗的最適宜條件，選用L9(34)表進(jìn)行正交試驗，以提取液中總黃酮的含量高低為考察指標(biāo)，確定鳳眼蓮干粉中總黃酮提取的最佳條件。因素與水平設(shè)計見表1。正交試驗結(jié)果見表2。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可直接看出，其中以試驗號3所得的粗提液中總黃酮的含量最高，100 mL的粗提液中含總黃酮9．75 mg，即A1B3C3D3為較好的工藝。從極差R值的大小可以看出粗提液中總黃酮含量影響的大小順序依次為B-乙醇濃度(%)、C-料液比、D-微波火力、A-微波時間(min)。因此從計算結(jié)果可以得出，A1B3C2D2為最佳條件。

由于正交表中所有的列都被因素占據(jù)，沒有空白列，從而無法得到誤差的估計，對于這種情況應(yīng)取各列偏差平方和最小的近似當(dāng)作誤差的估計(上海市科學(xué)技術(shù)交流站，1975)。因素A的極差較小，所以將此列作為方差分析的誤差列，對正交后的結(jié)果進(jìn)行方差分析(中國科學(xué)院數(shù)學(xué)研究所統(tǒng)計組，1977)，詳見方差分析表3。

方差分析結(jié)果表明，在所設(shè)的不同水平的乙醇濃度下，其提取效果有非常顯著的差異，料液比的影響達(dá)到顯著水平。但A1B3C2D2不包括在正交試驗設(shè)計表內(nèi)，因此通過驗證試驗證明該條件下所得的總黃酮含量是否比試驗號3更高。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2．5．2 乙醇濃度對總黃酮提取的影響 在A1B3C2D2工藝下驗證試驗，結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗Table 4 The result of verifiability test

在A1B3C2D2工藝下，100 mL的粗提液中總黃酮平均含量為9．76 mg，比試驗號3提高了0．103%，進(jìn)一步確定了鳳眼蓮總黃酮提取的最佳條件是A1B3C2D2，即微波時間2 min，乙醇濃度50%，料液比1:80，微波火力M．Low。

3 討論

本文中微波法提取時間比文獻(xiàn)熱水浸提法、超聲波法明顯縮短(余芳麗等，2008)，原因可能是微波火力比超聲波猛烈，很快就能提取出大量總黃酮，比較節(jié)省時間。目前天然產(chǎn)物總黃酮的提取對熱水浸提法和超聲波法報道較多，微波法提取時間短，對器皿的要求也不高，具有較高的研究價值。對微波法的正交試驗探討，得出最佳條件是A1B3C2D2與單因素試驗最佳條件很接近，只是在微波時間上略有不同。

1．確定了以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對照品的可見分光光度計法測定總黃酮含量，其檢測波長為510 nm;回歸方程為:A=0．00128+10．75625C，相關(guān)系數(shù) R=0．99968。

2．通過對影響總黃酮的因素進(jìn)行微波正交試驗和影響因素分析，結(jié)果表明乙醇提取鳳眼蓮中總黃酮的微波法最佳工藝條件為:微波時間2 min，乙醇濃度50%，料液比1:80，微波火力M．Low。

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