不同中醫(yī)證型艾滋病患者CD4+T淋巴細胞增殖與凋亡的初步探討＊

馬建萍，馬秀蘭，張 穎，艾合買提，李靜茹，曾 琳

(新疆國家中醫(yī)臨床研究基地艾滋病研究室，烏魯木齊 830000)

HIV病毒侵襲人體后，病毒選擇性地吸附在靶細胞的CD4+T淋巴細胞受體上產(chǎn)生一系列的反應，最終通過對CD4+T淋巴細胞的破壞達到對機體免疫系統(tǒng)的破壞［1］。HIV gp120、gp41與 CD4+T 淋巴細胞的CD4分子及CCR5結(jié)合，直接感染CD4+T淋巴細胞，還可通過“旁觀者”效應和活化誘導的細胞凋亡機制，導致感染和非感染的CD4+T淋巴細胞死亡［2］，造成CD4+T淋巴細胞的嚴重免疫缺陷，這是HIV感染導致CD4+T淋巴細胞數(shù)量減少的主要原因。本研究通過對不同中醫(yī)證型艾滋病患者CD4+T淋巴細胞增殖與凋亡的情況進行比較分析，探討中醫(yī)證型與CD4+T淋巴細胞增殖與凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

所有艾滋病患者均來自2011年10月 ～2011年11月在新疆烏魯木齊市沙依巴克區(qū)疾病預防控制中心隨訪的患者，并簽署知情同意書。初診時根據(jù)患者癥狀、舌、脈象，按照中醫(yī)辨證分型分為氣陰兩虛肺腎不足、肝腎陰虛濕毒蘊結(jié)、氣郁痰阻瘀血內(nèi)停3組，共收集病例79例，其中氣陰兩虛肺腎不足型25例，肝腎陰虛濕毒蘊結(jié)型28例，氣郁痰阻瘀血內(nèi)停型26例。氣陰兩虛肺腎不足型年齡23～46歲，平均(35.96±7.03)歲;肝腎陰虛濕毒蘊結(jié)型年齡19～49歲，平均(35.79±7.07)歲;氣郁痰阻瘀血內(nèi)停型年齡26～49歲，平均(37.12±5.00)歲。3組患者均未接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly Active Antiretroviral Therapy，HAART)治療。

1.2 辨證分組

按照中醫(yī)辨證分型的方法，參照《艾滋病中醫(yī)診療指南》(中國中醫(yī)藥出版社，中華中醫(yī)藥學會防治艾滋病分會編，2008年)、《中醫(yī)藥治療艾滋病臨床技術方案》(試行)、《中醫(yī)診斷學》，由兩名副主任醫(yī)師以上職稱的中醫(yī)大夫現(xiàn)場辨證，分為氣陰兩虛肺腎不足、肝腎陰虛濕毒蘊結(jié)、氣郁痰阻瘀血內(nèi)停3組。

1.3 淋巴細胞增殖與凋亡的觀察

清晨取患者空腹靜脈血5mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝;試劑使用 BD公司生產(chǎn)的 Annexin V及Ki-67試劑，以Ki-67標記細胞增殖，Annexin V標記細胞凋亡;通過BD公司流式細胞儀FACS Calibur計數(shù)。

1.4 實驗室檢測步驟

1.4.1 細胞凋亡步驟 (1)取100ul全血，加2ml溶血素(專用)，室溫放置 10min，離心(1500r/5min)去上清。加入2ml Binding Buffer(1×)-蒸餾水10倍稀釋，離心去上清;(2)加抗體(Annexin VFITC，PI)5μL，4℃ 孵育 15min。加 400μL Binding Buffer;(3)上機檢測。流式細胞儀BD Facs calibur。獲取分析軟件Cell quest Pro。上機獲取10000個淋巴細胞。

1.4.2 Ki-67檢測步驟 (1)細胞表面染色(取10ul CD4-Percp抗體)，加100ul全血，室溫避光15min。加入固定破膜劑 A100ul，固定5min;(2)加入2ml溶血素，室溫放置10min，離心(2000r/5min)去上清;(3)加入固定破膜劑B50ul，同時加入胞內(nèi)染色抗體Ki-67 10ul，對照管加入10ul Mouse IgG1-FITC。室溫避光30min;(4)加入2ml PBS混勻、離心(2000r/5min)去上清;(5)加入500ul PBS，上機檢測(步驟同上)。

1.4.3 CD4+T淋巴細胞的檢測 取患者新鮮抗凝血標本100，放入樣品測定管，加入相應的熒光標記單克隆抗體，振蕩混勻，室溫下避光孵育20～30min，加入溶血素，溶血完畢后上機檢測。采用流式細胞儀BD Facs calibur，獲取分析軟件 Cell quest Pro，上機獲取10000個淋巴細胞，對CD4+T淋巴細胞的百分比進行檢測分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行處理。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，各組之間CD4+T淋巴細胞的比較在方差齊、符合正態(tài)性分布的條件下采用單因素方差分析;各組間兩兩比較采用LSD檢驗方法，方差不齊、不符合正態(tài)性分布的條件下采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+T淋巴細胞占淋巴細胞比率

表1顯示，在3種不同證型患者的CD4+T淋巴細胞比率進行比較，其差異有統(tǒng)計學意義。表2顯示，經(jīng)兩兩比較，肝腎陰虛濕毒蘊結(jié)型和氣郁痰阻瘀血內(nèi)停型之間差異有統(tǒng)計學意義。

表1 不同證型患者淋巴細胞中CD4+細胞比率的比較

2.2 淋巴細胞凋亡比較

表3顯示，對于3種不同中醫(yī)證型患者血清淋巴細胞凋亡百分比進行比較，以Annexin V-PI標記細胞凋亡。3組患者淋巴細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義。

表2 不同證型間淋巴細胞中CD4+細胞比率的兩兩比較

表3 不同中醫(yī)證型患者血清淋巴細胞凋亡的比較

2.3 淋巴細胞增殖的比較

表4顯示，對于3種不同中醫(yī)證型患者血清淋巴細胞增殖進行比較，以 Ki-67標記細胞的增殖。在3種不同中醫(yī)證型間，患者淋巴細胞增殖情況比較差異無統(tǒng)計學意義。

表4 不同中醫(yī)證型患者血清淋巴細胞增殖的比較

2.4 CD4+T細胞增殖的比較

表5顯示，對于3種不同證型患者血清CD4+T淋巴細胞的增殖進行比較，在3種不同中醫(yī)證型間，患者CD4+T淋巴細胞增殖情況的差異無統(tǒng)計學意義。

表5 不同證型患者血清CD4+T淋巴細胞增殖的比較

3 討論

文獻研究報道［3］，HIV/AIDS患者 CD4+T淋巴細胞計數(shù)分布與證型有相關性，CD4+T淋巴細胞計數(shù)在200/μL以下時，以氣虛血瘀、邪毒壅滯型和脾腎虧虛、濕邪阻滯型多見;計數(shù)在201～350/μL之間時，以氣虛血瘀、邪毒壅滯型，氣陰兩虛、肺腎不足型和脾腎虧虛、濕邪阻滯型多見;計數(shù)大于350/μL時，以氣血兩虧型和氣虛血瘀、邪毒壅滯型多見。本研究是以患者CD4+T細胞占淋巴細胞的比率進行比較，在3組不同證型間差異有統(tǒng)計學意義。其中肝腎陰虛濕毒蘊結(jié)型與氣郁痰阻瘀血內(nèi)停型之間CD4+T淋巴細胞的比率有差異。由此可見，CD4+T淋巴細胞可作為中醫(yī)證型判別的依據(jù)，其絕對值和相對值均可為中醫(yī)證型的判別提供參考。

細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施。在胚胎發(fā)育階段通過細胞凋亡清除多余的和已完成使命的細胞，保證了胚胎的正常發(fā)育;在成年階段通過細胞凋亡清除衰老和病變的細胞，保證了機體的健康。與細胞增殖一樣，細胞凋亡也是受基因調(diào)控的精確過程。

研究表明［3］，HIV感染者CD4+T淋巴細胞的減少與細胞凋亡有密切關系，通過檢測 HIV感染者CD4+T淋巴細胞凋亡率有助于判斷疾病進程。

隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中醫(yī)藥在艾滋病的診療過程中發(fā)揮著日益重要的作用。深入研究中醫(yī)理論，運用現(xiàn)代醫(yī)學的手段和方法有助于更好地認識和推廣中醫(yī)。本研究的目的旨在通過對不同中醫(yī)證型間CD4+T淋巴細胞增殖與凋亡的關系進行比較，以探索中醫(yī)分型與免疫學的關系。經(jīng)過本實驗，在不同中醫(yī)證型間患者CD4+T淋巴細胞的增殖與凋亡差異無統(tǒng)計學意義。由于本研究所選取的患者均為AIDS患者，其CD4+T淋巴細胞的增殖與凋亡沒有差異，提示其細胞增殖與凋亡處于相同水平。但是3組患者CD4+T淋巴細胞比率存在差異，提示造成其差異的原因可能除了細胞增殖與凋亡外，還有其他因素。

在細胞凋亡的試驗過程中，由于采用的CD4-PERCP與PI是一個發(fā)射波長，所以不能夠?qū)D4+T淋巴細胞的凋亡進行分析，僅對淋巴細胞的凋亡進行了分析。在今后的工作中，可以進一步對此進行研究。

［1］林云霞，劉學真，鄭薇，等.山東省全球基金艾滋病項目地區(qū)抗病毒治療病人CD4+T細胞計數(shù)變化分析［J］.中華疾病控制雜志，2009，13(4):484-485.

［2］曾耀英.HIV感染發(fā)病學的新概念［J］.河南中醫(yī)學院學報，2005，20(4):1-5.

［3］王曉雪，危劍安，宋春鑫，等.320例經(jīng)血感染HIV/AIDS中醫(yī)證型分布與 CD4+T淋巴細胞計數(shù)、病毒載量關系的探討［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5(5):410-413.