蛋白多肽類藥物聚乙二醇化修飾研究進展

楊 旭 貢濟宇

長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林長春 130000

蛋白多肽類藥物聚乙二醇化修飾研究進展

楊 旭 貢濟宇▲

長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林長春 130000

近年來，越來越多具有生物活性的蛋白多肽類藥物被發(fā)現(xiàn)，因其生理功能上的高效性及專一性而廣泛用于治療各種疾病。但由于其在體內(nèi)易被降解，且生物半衰期短，使其應用受到了限制。通過化學修飾的方法，可以延長蛋白肽類藥物的生物半衰期，提高藥效，降低副作用。聚乙二醇能有效增加蛋白多肽類藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，本文就聚乙二醇共價連接修飾蛋白質(zhì)及多肽類藥物做一綜述。

蛋白質(zhì)；多肽；聚乙二醇化；研究進展

隨著基因工程、生物制藥及肽類藥物固相合成技術(shù)的發(fā)展，許多極具開發(fā)和應用前景的多肽蛋白類藥物逐漸受到關(guān)注，且在疾病的診斷、預防及治療中占有越來越重要的位置。但這類藥物穩(wěn)定性差，在生物體內(nèi)半衰期較短，所以提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性成為研究焦點。聚乙二醇（PEG）是中性、無毒、無免疫原性、有良好的生物相容性的高分子聚合物，具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動力學體積，當耦聯(lián)到藥物分子表面時，可改變其生物分配行為和溶解性，產(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中被快速消除。將蛋白肽類藥物進行PEG修飾，可以提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，以改善體內(nèi)半衰期，因而被廣泛用于蛋白多肽藥物的修飾，以改善該類藥物在體內(nèi)的性質(zhì)。本文對PEG的性質(zhì)、修飾策略及研究現(xiàn)狀等方面進行綜述。

1 聚乙二醇的性質(zhì)及選擇

PEG是經(jīng)環(huán)氧乙烷聚合生成的一類高分子化合物。它不僅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、乙腈和乙醇等有機溶劑。通過化學反應先在PEG上連接“小分子臂”，再通過連接臂與化合物相接，這一過程稱為PEG的活化，活化后的PEG即為PEG修飾劑。本文總結(jié)了近年來新興的幾種聚乙二醇修飾劑，見表1。

PEG修飾劑的選擇決定了修飾后藥物的性質(zhì)，一個理想的PEG修飾劑至少滿足以下條件：（1）無毒，無免疫原性且生化性質(zhì)穩(wěn)定。（2）一端有耦聯(lián)反應活性基團，另一端則被封閉，以避免藥物分子之間交叉耦聯(lián)。（3）選擇具體位點PEG化，以確保得到保持最大活性的高重復性產(chǎn)品。（4）盡量使用分支型PEG。（5）PEG分子量的選擇要綜合考慮生物活性和藥代動力學兩方面的因素。目前普遍采用分子量大于2萬的PEG作為修飾劑。

表1 新型聚乙二醇修飾劑

2 蛋白多肽類藥物的聚乙二醇修飾策略

蛋白多肽的PEG化通常以其分子中的氨基、羧基和巰基等官能團為活性位點選擇相應類型的PEG進行修飾。蛋白多肽在PEG修飾時要根據(jù)蛋白質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系，選擇不與受體結(jié)合的殘基作為修飾位點，以保證修飾后的生物活性。下面根據(jù)不同的修飾位點分別介紹幾種常見的PEG修飾方法。

2.1 氨基修飾

氨基修飾是最為常用的PEG修飾方法，早期PEG修飾主要針對α或ε的氨基[1]，典型代表有琥珀酰亞胺碳酸酯PEG、苯并三唑碳酸酯PEG等。這類修飾劑反應所需要條件較為溫和，對藥物穩(wěn)定性影響相對較小。但其反應選擇性低、副產(chǎn)物多、鍵結(jié)合不穩(wěn)定且PEG自身雜質(zhì)的干擾較為嚴重，因而逐漸被新一代PEG所替代。

新一代PEG的類型和種類更加多樣化，修飾目標更為明確。其典型代表是丙醛-mPEG。Kinstler OB等[2]研究發(fā)現(xiàn)，醛基和伯胺通過Schiff堿，形成一個穩(wěn)定的伯胺，在pH值約為5時，N末端的α氨基與醛基有很高的選擇性。

2.2 巰基修飾

蛋白質(zhì)上的巰基對PEG呈現(xiàn)高度的選擇性，典型代表有馬來酰亞胺聚乙二醇、乙烯磺酸聚乙二醇等。這種方法的優(yōu)點是使PEG連接在蛋白質(zhì)特定的位置，最低程度減少生物活性；缺點是游離的巰基會增加二硫鍵雜質(zhì)和蛋白質(zhì)二聚體的可能性。

2.3 糖基或N末端修飾

糖基或N末端的絲氨酸或蘇氨酸是PEG定點修飾蛋白多肽的另一方法。糖基可被酶或高碘酸鈉氧化，形成多種活性的醛基，與聚乙二醇-肼或氨生成可逆的Schiff堿[3]。此法可產(chǎn)生多個成鍵位點，但只對糖有選擇性。蛋白質(zhì)中絲氨酸或蘇氨酸的N末端也可采取定點修飾，可被高碘酸氧化成乙醛酸衍生物。Gaertner HF等[4]用此方法成功地將白介素-8的N末端絲氨酸成功耦聯(lián)上PEG。

2.4 可逆性修飾

PEG化的目的多數(shù)是在蛋白上形成一個穩(wěn)定的連接鍵，利于耦聯(lián)物長期保存和純化等。但人們注意到，PEG與蛋白形成的穩(wěn)定的連接鍵有時會占據(jù)或屏蔽蛋白質(zhì)的活性位點而降低其活性?？赡嫘孕揎椏梢栽诓桓淖兓钚缘那闆r下增加藥物的半衰期。Enzon公司在酸性條件下將PEG-SC和干擾素α-2b耦聯(lián)[5]，使PEG聚集到His34上，而進入體內(nèi)后的一段時間，PEG就從蛋白質(zhì)上緩慢釋放，從而保證了藥物的生物活性。

PEG修飾反應需要有高度的特異性和溫和的反應條件，因此，要針對不同藥物的性質(zhì)選擇合適的PEG修飾劑。而對某個藥物的修飾方法目前尚沒有成形的規(guī)律可循，仍需要研發(fā)人員根據(jù)實際情況逐步摸索完善。

3 PEG修飾技術(shù)的研究現(xiàn)狀

目前的PEG修飾技術(shù)均為藥物與PEG的共價結(jié)合，這可能會造成藥物的聚集，體內(nèi)活性全部或部分失活。近年來新開發(fā)的非共價結(jié)合技術(shù)可有效地解決上述問題。這種技術(shù)是基于PEG衍生物的疏水基團與蛋白質(zhì)疏水表面間的疏水相互作用，使PEG形成的空間位阻能夠屏蔽蛋白質(zhì)間的相互作用，而減少聚集現(xiàn)象[6-8]。Mueller C等[9]利用色氨酸作為疏水基團與mPEG結(jié)合，再用于修飾降鈣素，所得產(chǎn)物與丹磺酰-PEG化降鈣素相比，在較惡劣的條件下能更好地抑制PEG化降鈣素的聚集。

PEG修飾技術(shù)不僅應用于蛋白多肽類藥物，近幾年在納米醫(yī)藥領(lǐng)域也有應用。PEG修飾的納米粒可避免被單核巨噬細胞吞噬系統(tǒng)（MPS）識別，進而影響其體內(nèi)的生物分布，并延長在血中的循環(huán)時間。目前，PEG化殼聚糖納米顆粒及PEG化脂質(zhì)體等給藥系統(tǒng)均有良好的效果[10-11]。

近年來，隨著對PEG化蛋白多肽類藥物的不斷深入研究，許多蛋白多肽類藥物的PEG修飾已卓有成效。諸多國際知名的制藥公司已經(jīng)或正在積極推進蛋白藥物的PEG修飾，自1991年第一種用PEG修飾的蛋白藥物PEG-ADA被美國FDA批準上市后，近幾年上市的PEG修飾的藥物也層出不窮[12]。如PEG化干擾素，這種新型干擾素制劑每周只需注射1次，而普通干擾素注射劑的藥效僅能維持24 h，用于治療包括乙型肝炎在內(nèi)的各種病毒性感染疾病。目前，國內(nèi)的PEG修飾技術(shù)也正在蓬勃發(fā)展。由石藥集團生產(chǎn)的聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子注射液 （商品名為津優(yōu)力）已于2012年3月17日獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準上市，成為我國第首個上市的PEG修飾藥物。該藥采用特有的定點修飾技術(shù)，將20 KD的PEG分子選擇性地與rhG-CSF蛋白質(zhì)N末端定點交聯(lián)而成，所得到的產(chǎn)物具備明確而單一的結(jié)構(gòu)。PEG分子沒有毒性和免疫原性，并可被機體安全清除，而rhG-CSF經(jīng)PEG修飾后，其血漿半衰期延長（達47 h）、免疫原性降低、生物利用度提高、穩(wěn)定性增強、安全性更高。近些年來，由于國內(nèi)許多制藥公司對PEG修飾技術(shù)不斷的深入研究，現(xiàn)已有十多種PEG修飾藥物審報臨床審批（表2），相信在不久的將來，將有更多的PEG藥物問市。

隨著PEG化學的高速發(fā)展以及許多PEG衍生化試劑的商品化、PEG化藥物的陸續(xù)上市，可以預測藥物的PEG修飾研究將得到越來越廣泛和深入的重視，特別在提高蛋白、多肽藥物的穩(wěn)定性、延長半衰期，降低抗腫瘤藥、抗真菌藥、抗生素、免疫抑制劑的毒副作用和提高這些藥物的靶向性，PEG修飾更具有持續(xù)的魅力和非常廣闊的前景。

表2 國內(nèi)PEG修飾藥物研究現(xiàn)狀

[1]姜忠義，許松偉，高蓉.生物分子化學修飾用聚乙二醇衍生物的合成及應用[J].高分子通報，2002，（1）：34-40.

[2]KinstlerOB，BremsDN，LaurenSL，etal.Characterizationandstabilityof N-terminally PEGylated rhG-CSF[J].Pharm Res，1996，13（7）：996-1002.

[3]Harris J，Zalipsky S.Poly（ethyleneglycol） Chemistry and Biological Applications[M].Washington DC：ACS Books，1997：347-381.

[4]Gaertner HF，Offord RE.Site-specific attachment of functionalized poly（ethylene glycol） to the amino terminus of proteins[J].Bioconjug Chem，1996，7（1）：38-44.

[5]Kozlowski A，Harris JM.Improvements in protein PEGylation：pegylated interferons for treatment of hepatitis C[J].Control Release，2001，72（1）：217-224.

[6]Siato A，Myiauchi E.Stabilized protein-containing formulations：USA，20090264629[P].2011-05-05.

[7]Rodrigu-Martínez JA，Rivera-Rivera I.Prevention of benzyl alcohol-induced aggregation of chymotrypsinogen by PEGylation[J].J Pharm Pharmacol，2011，63（6）：800-805.

[8]惠希武，陳虹.蛋白質(zhì)、多肽類藥物聚乙二醇修飾的研究進展[J].中國生物制品學雜志，2012，25（4）：520-524.

[9]Mueller C，Capelle MA.Tryptophan-mPEGs：novel excipients that stabilize salmon calcitonin against aggregation by non-covalent PEGylation[J].Eur J Pharm Biopharm，2011，79（3）：646-657.

[10]Kang EY，Moon HJ，Joo MK，et al.Thermogelling chitosan-g-（PAFPEG）aqueous solution as an injectable scaffold[J].Biomacromolecules，2012，13（6）：1750-1757.

[11]Knudsen NO，Ronholt S，Satle RD，et al.Calcipotriol delivery into the skin with PEGylated liposomes[J].Eur J Pharm Biopharm，2012，81（3）：532-539.

[12]Ryan SM，Mantovani G，Wang X，et al.Advances in PEGylation of important biotech molecules：delivery aspects[J].Expert Opin Drug Deliv，2008，5（4）：371-383.

Research progress on PEGylation of protein and peptide drugs

YANG Xu GONG Jiyu▲
College of Pharmacy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130000,China

More and more protein and peptide drugs are discovered in recent years.It is used for treating numerous diseases because of its high efficiency and specificity.In fact,its application has been limited because of the short half-life.The method of chemical modification is useful to prolong the half-life,it can improve activity and reduce side effect.The PEGylation can effectively increase the protein peptide drugs in vivo stability.This paper discusses some methods of chemical modification of proteins and peptides by PEG conjugation.

Protein;Peptide;PEGylation;Research progress

R914

A

1674-4721（2012）11（a）-0016-03

楊旭（1984-），男，碩士研究生；研究方向：蛋白肽類藥物合成。

▲通訊作者

2012-06-25 本文編輯：陳 ?。?/p>