不同質(zhì)量濃度的黃芪總黃酮對高糖培養(yǎng)下牛視網(wǎng)膜血管周細胞DNA損傷的影響

江 紅 匡洪宇 劉 余 馬麗麗 康英英

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的嚴重微血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致失明。DR的發(fā)病機制尚不明確，最近研究表明高血糖導(dǎo)致的DNA氧化損傷是DR發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)，阻斷這一環(huán)節(jié)可以阻斷DR發(fā)生的其他病理進程［1］。黃芪總黃酮是黃芪有效部位的提取物，是黃芪中清除自由基的主要活性成分，具有明顯的抗氧化和自由基清除活性。本實驗通過研究不同質(zhì)量濃度黃芪總黃酮培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜微血管周細胞DNA損傷情況，探討其對牛視網(wǎng)膜微血管周細胞DNA損傷的影響，為黃芪治療DR的臨床研究及應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 藥物 取黃芪10 kg，以95%乙醇減壓回流提取3次，合并，濃縮至浸膏，取浸膏加蒸餾水溶解，用醋酸乙酯萃取數(shù)次，合并萃取液，濃縮，過柱，得總黃酮。提取物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)實驗室鑒定。用前以磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2 試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（低糖，美國Hyclone公司），優(yōu)級胎牛血清（天津灝洋生物公司），膠原酶Ⅱ型（美國Invitrogen公司），雙抗（大連美羅大藥廠），胰酶、多聚賴氨酸、單克隆抗體及免疫組化試劑盒（武漢博士德生物公司）、低熔點瓊脂糖（德國Merck-Darmstadt公司）、熒光顯微鏡、DYY-32型電泳儀以及細胞培養(yǎng)相關(guān)材料。

1.3 視網(wǎng)膜毛細血管周細胞的原代培養(yǎng)及鑒定 采用的培養(yǎng)方法參照Li等［2］的實驗。分離胎牛眼視網(wǎng)膜，勻漿，0.2%膠原酶37℃消化40 min，200目篩網(wǎng)過濾，濾心，加入含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，接種入50 cm培養(yǎng)瓶中，在37℃含5%CO2及90%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)，再去除培養(yǎng)液，烤干后采用鼠抗α平滑肌肌動蛋白抗體及兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體，進行視網(wǎng)膜血管周細胞免疫組化鑒定。

1.4 分組與處理 取體外培養(yǎng)3代融合的周細胞，用培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。細胞貼壁后更換不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)液，對照組加入含20%血清的低糖 DMEM（5.5 mmol/L），模型組為高糖組（25 mmol/L），干預(yù)組為在模型組中加入不同質(zhì)量濃度的黃芪總黃酮1、2、3、4組（0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL），孵育 6 d。

1.5 彗星試驗 參照Hockemeyer［3］的方法改良。制備0.5%的正常熔點瓊脂糖和0.5%的低熔點瓊脂糖。取細胞懸液與0.5%低熔點瓊脂糖混勻后加到預(yù)處理過的磨砂玻片上，經(jīng)細胞裂解和DNA解旋后于4℃、25 V、300 mA條件下電泳25 min；經(jīng)過中和、EB染色、低溫避光，最后在熒光顯微鏡下計數(shù)拖尾細胞百分數(shù)（彗星率）并測量拖尾細胞尾長。每個樣本隨機測量100個彗星細胞的尾長和300個細胞中彗星樣細胞的數(shù)目

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用單因素方差分析及直線相關(guān)回歸分析方法統(tǒng)計數(shù)據(jù)資料。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的BRPs 1～2 d后貼壁，貼壁后逐漸伸展，呈不規(guī)則多角形，胞體不大，可見突起，生長較快，1～2周BRPs可達到融合，細胞密集，無接觸性抑制。α平滑肌肌動蛋白抗體染色顯示BRPs胞漿內(nèi)呈特異性棕黃色著色，陽性率達99%以上，兔抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色BRPs胞漿不著色。

2.2 各組周細胞DNA損傷比較 見表1。與高糖組相比，黃芪總黃酮各組周細胞彗尾長度及彗星率降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并隨著質(zhì)量濃度的增加，周細胞彗尾長度及彗星率降低呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討 論

視網(wǎng)膜組織是眼睛的多層感覺組織，富含多不飽和脂肪酸，它對ROS和脂質(zhì)過氧化物特別敏感。自由基活性增強和抗氧化能力降低是DR發(fā)生的重要機制。已有臨床研究證實以黃芪為主要成分的中藥顆粒對保護周細胞、防止周細胞消失及基底膜增厚有較好療效。實驗表明黃芪總黃酮可降低細胞脂質(zhì)過氧化物的生成，直接清除羥自由基和超氧陰離子自由基，對DNA損傷有明顯的保護作用。而最近研究發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮具有抗突變、抗腫瘤和抑制動脈粥樣硬化等多種生物學(xué)效應(yīng)［4］。

表1 各組彗尾長度與彗星率比較（）

表1 各組彗尾長度與彗星率比較（）

與對照組比較，*P＜0.01；與高糖組比較，△P＜0.01；與黃芪總黃酮1組比較，▲P＜0.01；與黃芪總黃酮2組比較，#P＜0.01；與黃芪總黃酮3組比較，○P＜0.01。

組別 n 彗尾長度 彗星率（%）對照組 7 6.15±0.63 7.77高糖組 7 23.70±4.775* 47.77*黃芪總黃酮1組 7 19.11±1.51* 36.23*黃芪總黃酮 2組 7 17.74±2.56*△▲ 24.32*△▲黃芪總黃酮 3 組 7 14.40±3.3*△▲# 16.04*△▲#黃芪總黃酮 4 組 7 10.54±2.34*△▲#○ 13.56*△▲#○

本研究結(jié)果顯示一定質(zhì)量濃度的黃芪總黃酮對高糖培養(yǎng)下的牛視網(wǎng)膜微血管周細胞DNA損傷有明顯的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，周細胞的DNA損傷降低。提示黃芪總黃酮對視網(wǎng)膜血管周細胞有一定保護作用，是一種很有前途的臨床抗氧化劑。研究證實抗氧化劑的應(yīng)用不僅能抑制氧自由基誘導(dǎo)的細胞凋亡，而且能防止糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生。徐寒松等［5］研究顯示以黃芪為主要成分的通脈糖眼明膠囊能夠改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，對于DR具較好療效。本研究證實，一定質(zhì)量濃度的黃芪總黃酮能夠抑制牛視網(wǎng)膜微血管周細胞氧化損傷，為臨床應(yīng)用黃芪總黃酮治療DR提供了理論依據(jù)。（第一作者現(xiàn)在黑龍江省醫(yī)院工作）

［1］Johansen JS，Harris AK，Rychly DJ，et al.Oxidative stress and the use of antioxidants in diabetes：linking basic science to clinical practice［J］.Cardiovasc Diabetol，2005，4（1）：5.

［2］Li AF，Sato T，Haimovici R，et al.High glucose alters connexin 43 expression and gap unction intercellular communication activity in retinalpericytes［J］.InvestOphthalmolVisSci，2003，44（12）：5376-5382.

［3］Hockemeyer D，Sfeir AJ，Shay JW，et al.POT1 protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end［J］.EMBOJ，2005，24（14）：2667-2678.

［4］劉漢丹，瞿佐發(fā).黃芪的藥理作用研究進展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，11（18）：1861-1862.

［5］徐寒松，孔德明，李雪梅，等.通脈糖眼明膠囊治療單純型糖尿病性視網(wǎng)膜病變臨床研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21（9）：567-569.