黃芩苷鑭(Ⅲ)、釔(Ⅲ)配合物的合成及生物活性研究

張齊雄，施倫勇，劉衍季

西南大學藥學院，重慶400715

黃芩苷鑭(Ⅲ)、釔(Ⅲ)配合物的合成及生物活性研究

張齊雄*，施倫勇，劉衍季

西南大學藥學院，重慶400715

改進以往反應(yīng)條件，合成了黃芩苷鑭(Ⅲ)、黃芩苷釔(Ⅲ)配合物，利用IR、UV、LC-MS和金屬元素含量測定對配合物進行了表征。采用MTT法分別考察了兩種新化合物的抑菌活性(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌)和抗腫瘤活性(A549、HepG2)，采用灌胃法考察化合物對小鼠的急性毒性。結(jié)果表明:黃芩苷在與金屬配合后，結(jié)構(gòu)表征發(fā)生了一定的變化，配合物無金屬離子毒性反應(yīng)，并且其抑菌、抗腫瘤作用均顯示出黃芩苷鑭＞黃芩苷釔＞黃芩苷。

稀土金屬;黃芩苷;配合物;抗菌;抗腫瘤

稀土金屬在抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性方面與黃酮類化合物有相似之處［1-6］;但稀土無機鹽的毒性作用［7，8］限制了其應(yīng)用前景，故將黃酮類與稀土金屬離子配合不僅可以降低金屬離子毒性［9］，也能增強其活性。黃芩苷可與過渡金屬如鋅、鋁、鉻、銅等生成穩(wěn)定的配合物［10-13］，但其反應(yīng)均選擇在有機溶劑、強堿條件下進行，產(chǎn)率低。改進實驗反應(yīng)條件，得到高產(chǎn)率的黃芩苷鑭和黃芩苷釔兩種配合物，并對其抗菌抗腫瘤活性進行研究。

1 黃芩苷稀土金屬配合物合成及表征

1.1 儀器及試劑

黃芩苷(西安小草植物科技有限責任公司，純度大于95%，批號XC090722)，LaCl3·7H2O(分析純)、Y(NO3)3·6H2O(分析純)、EDTA(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)，85-1恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)，紅外光譜儀(PerkinElmer FT-IR Spectrometer Spectrum One，PerkinElmer公司)，U-1800紫外掃描儀(Hitach公司)，質(zhì)譜(Bruker HCT ESI-MS(300 MHz)Spectrometer、ABI公司)。

1.2 黃芩苷稀土金屬配合物的合成

準確稱取黃芩苷3 g，加入到100 mL水中，邊攪拌邊按摩爾比1∶1逐滴加入0.565 g NaHCO3溶液，待黃芩苷完全溶解后，再分別加入不同摩爾比(3∶1、2∶1、1∶1)的LaCl3·7H2O，Y(NO3)3·6H2O溶液，30℃下攪拌反應(yīng)約2 h，分別得到帶有金屬光澤的棕黑色和棕紅色沉淀，經(jīng)過蒸餾水數(shù)遍洗滌，50℃下烘干至恒重。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 產(chǎn)物金屬元素含量分析

由表1中金屬含量接近理論值可知，黃芩苷與兩種金屬以不同摩爾比反應(yīng)時，所得產(chǎn)物均為三分子黃芩苷絡(luò)合一分子金屬的結(jié)構(gòu)。

表1 黃芩苷-鑭、釔配合物的金屬含量Table 1 Metal content of baicalin complexes with La(III)、Y(III)

1.3.2 紫外圖譜分析

黃芩苷在275 nm及316 nm有兩個最大吸收峰，而配合物在275 nm的吸收峰微紅移至277 nm，316 nm波長處吸收峰消失，表明發(fā)生配位后，黃芩苷結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，又因金屬具有一定的吸電子作用，使電子躍遷所需的激發(fā)能減小及整個分子的電子離域程度增大，故而發(fā)生紅移。

1.3.3 紅外圖譜分析

黃芩苷及其稀土配合物主要基團的紅外數(shù)據(jù)見表2。

表2 黃芩苷及其稀土配合物主要基團的紅外數(shù)據(jù)(cm-1)Table 2 Position of the most important bands in IR spectra of baicalin and its complexes

推測氧的孤對電子與金屬離子的空軌道形成配位鍵后導致C=O的電子云密度降低，故使得配合物4位C=O的伸縮振動吸收峰較黃芩苷紅移53 cm-1。配合物較黃芩苷5位O-H的伸縮振動吸收峰分別紅移了約42 cm-1和35 cm-1，說明黃芩苷的酚羥基氧也與金屬離子發(fā)生了作用。另由于金屬離子對C-O中氧的電子離域作用使得C-O的伸縮振動吸收峰紅移了約9 cm-1和13 cm-1。綜上，黃芩苷的4位C=O和5位OH與金屬離子發(fā)生了配位。

1.3.4 質(zhì)譜分析

黃芩苷-鑭的分子離子峰為1473.8，碎片峰1297.2為分子離子斷裂失去一分子葡萄糖苷(176 Da)所得，碎片峰445.7為分子離子斷裂后所得黃芩苷(445 Da)的峰，因此，推定黃芩苷-鑭配合物由黃芩苷×3+La組成。另根據(jù)紅外結(jié)果知其在4位C=O和5位OH配位，因此，推定黃芩苷-鑭的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

黃芩苷-釔的分子離子峰為1422.9，碎片峰1247.9為分子離子斷裂失去一分子葡萄糖苷(176 Da)所得，碎片峰893.6為分子離子斷裂失去三分子葡萄糖苷(176 Da×3)所得，因此，推定黃芩苷-釔配合物由黃芩苷×3+Y組成。另根據(jù)紅外結(jié)果知其在4位C=O和5位OH配位，因此，推定黃芩苷-釔的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 黃芩苷-M的結(jié)構(gòu)(M=La或Y)Fig.1 Baicalin-M complex(M=La or Y)

2 黃芩苷-稀土金屬配合物生物活性

2.1 儀器、試劑及實驗動物

Thermo 6500二氧化碳培養(yǎng)箱，BioTek ELX800酶標儀，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)，96孔培養(yǎng)板(Costar公司)，胎牛血清(Gibco公司)，噻唑藍(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，胰蛋白酶(Amresco公司)，健康昆明小鼠(體重20±2 g，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(渝)2007-0001)。

2.2 急性毒性實驗

將黃芩苷及黃芩苷稀土金屬配合物溶于1% NaOH溶液中(最終pH為7.1)，配成10%黃芩苷或黃芩苷稀土金屬溶液，根據(jù)最大耐受劑量法［14］，每只小鼠灌胃給予5 g·kg-1，觀察兩周，所有小鼠活動均稍微減弱，短時間內(nèi)得到恢復，兩周后所有小鼠均未出現(xiàn)死亡，生長良好。

2.3 抗菌實驗

黃芩苷及其配合物使用1%NaOH溶解，溶液最終pH值為7.1。使用劃線法將金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌取得單個菌落并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，配置菌液濃度為2× 105個∕mL，采用96孔板法倍比稀釋5個濃度(濃度∕mg·mL-1∶2、1、0.5、0.25、0.125)的化合物，每個濃度設(shè)5個復孔，再在每個孔中加入等量的菌液，細菌在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h、真菌30℃培養(yǎng)48 h后，觀察各孔是否透明，對應(yīng)化合物溶液濃度最小的透明的孔即為最小抑菌濃度MIC，結(jié)果見表3。

表3 黃芩苷及其稀土配合物的MICTable 3 The antibacterial activity of baicalin and its complexes (MIC)

2.4 抗腫瘤實驗

取對數(shù)生長期的腫瘤細胞(A549、HepG2)用含10%胚牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×104個∕mL。接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出并更換培養(yǎng)基后，待細胞長至80%～90%融合時，加入不同劑量的黃芩苷及黃芩苷稀土金屬配合物溶液，使其終濃度(μM)分別20、40、80、160、320，每個濃度5個孔，每一濃度均設(shè)置溶劑對照。加藥培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT培養(yǎng)4 h，棄上清液后加入DMSO，振蕩并在酶標儀中于490 nm處測定吸光度(A)值。以溶劑對照組處理的腫瘤細胞為對照組，取5個復孔的平均值，根據(jù)公式:抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×l00%計算化合物對細胞的抑制率，計算出IC50，結(jié)果見表4。

表4 黃芩苷及其配合物的抗腫瘤活性(IC50)Table 4 The antineoplastic activity of baicalin and its rare earth metal compounds(IC50)

3 討論

3.1 合成

本實驗根據(jù)黃芩苷的結(jié)構(gòu)特點，選用等摩爾的NaHCO3溶解黃芩苷，一方面是其與黃芩苷糖元上的羧基成鹽后，水溶性大大增加，較以往文獻以吡啶做溶劑更為安全，產(chǎn)率提升了30%～70%左右。二是避免堿性太強造成與稀土元素形成沉淀，不利于配合物形成。故對于黃芩苷與其他稀土金屬配合物的合成具有參考意義。

本實驗合成得到未見報道的黃芩苷-鑭，并根據(jù)對產(chǎn)物一系列表征結(jié)果確定了配合物的分子結(jié)構(gòu)。而已有報道的黃芩苷-釔用常規(guī)方法絡(luò)合比為1∶1［15］，且該報道未能合成得到除鈰、釔以外的其他黃芩苷稀土金屬配合物。本實驗三種比例所得產(chǎn)物均為未見報道的絡(luò)合比為3∶1的新化合物，關(guān)于方法不同造成所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同的原因尚需進一步研究。

本實驗在反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間一定的條件下，考察了黃芩苷和稀土金屬反應(yīng)摩爾比對反應(yīng)產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表5

表5 黃芩苷稀土金屬配合物合成反應(yīng)的產(chǎn)率Table 5 The yield of synthesis reaction of baicalin with rare earth metal

由表5可知當黃芩苷與稀土金屬的摩爾比為3∶1，符合反應(yīng)方程式比例時，反應(yīng)產(chǎn)率最低，說明該反應(yīng)的平衡常數(shù)(K)值較小;而摩爾比為2∶1，即金屬較過量時，會有利于黃芩苷與其發(fā)生配合，原因可能是較高濃度的金屬離子使得K值增大，化學反應(yīng)平衡正向移動，產(chǎn)率增高;當摩爾比為1∶1時，反應(yīng)產(chǎn)率反而降低，可能是由于反應(yīng)體系黃芩苷濃度過低而不利于反應(yīng)進行。其具體原因尚需研究。

3.2 生物活性

急性毒性試驗表明黃芩苷-鑭、黃芩苷-釔對小鼠灌胃LD50＞5 g·kg-1。根據(jù)急性毒性(LD50)劑量分級，故可初步表明黃芩苷-鑭、釔配合物經(jīng)口給藥屬實際無毒范圍［14］。其毒性較低的原因可能是稀土金屬絡(luò)合后，其體內(nèi)代謝方式發(fā)生改變，加快了稀土金屬的代謝排出，體內(nèi)積累減少，使得配合物無金屬離子的毒性反應(yīng)。

由表3可知，除黃芩苷-釔對沙門氏菌的抗菌活性相比提升較小外，黃芩苷-鑭和黃芩苷-釔對上述5種菌(含革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌)的抗菌活性均較黃芩苷提升一倍以上，表明二者為廣譜抗菌化合物，特別是黃芩苷-鑭對白色念珠菌具有良好的抑菌效果。從表4中可得到黃芩苷-鑭和黃芩苷-釔對A549和HepG2生長的抑制效果明顯強于黃芩苷，且均為黃芩苷-鑭＞黃芩苷-釔。

合成得到的配合物的抗腫瘤作用強于黃芩苷，普遍認為原因是金屬配合物可通過插入到DNA的堿基對之間，通過破壞堿基堆積力，從而影響DNA分子的內(nèi)部構(gòu)型，從而抑制DNA分子的進一步遺傳和復制;另外配合物存在金屬，能使蛋白質(zhì)立體構(gòu)象發(fā)生變化以致蛋白質(zhì)變性，使得配合物對微生物的生長抑制作用增強;也可能是發(fā)揮了配體與金屬的協(xié)同作用。具體機制有待深入研究。

另外黃芩苷-鑭與黃芩苷-釔的其他生物活性如抗病毒、抗氧化、防治骨質(zhì)疏松癥等方面尚需進一步研究。由此可見對稀土金屬黃芩苷配合物的研究對稀土金屬的醫(yī)藥開發(fā)和傳統(tǒng)中藥的新應(yīng)用有著重要的意義。

1 Calgarotto AK，Miotto S，Honorio KM，et al.A multivariate study on flavonoid compounds scavenging the peroxynitrite free radical.J Mol Struct，2007，808(1-3):25-33.

2 Süzge?-Sel?uk S，Birteks?z AS.Flavonoids of Helichrysum chasmolycicum and its antioxidant and antimicrobial activities.S Afr J Bot，2011，77:170-174.

3 Hollman PCH，Katan MB.Dietary Flavonoids:Intake，Health Effects and Bioavailability.Food Chem Toxicol，1999，37: 937-942.

4 Zhang JC(張金超)，Yang MS(楊夢蘇).Research Progress on Drugs of Rare Earth Complexes.Chinese J of Rare Metal (稀有金屬)，2005，29:919-926.

5 Ji YJ(紀云晶)，Wang ZH(王宗惠)，Jia JL(賈建林). Study on the relationship between rear earth compound and cancer.J Health Toxicology(衛(wèi)生毒理學雜志)，1994，8: 164-170.

6 Prouillet C，Maziere JC，Maziere C，et al.Stimulatory effect of naturally occurring flavonols and kaempferof on alkaline phosphatase activity in MG-63 human osteoblasts through ERK and estrogen receptor pathway.Biochem.Pharmacology，2004，67:1307.

7 Qin JF(秦俊法)，Chen XY(陳祥友)，Li ZX(李增禧). Rare earth’s effects of toxicology.Guangdong Trace Elements Science(廣東微量元素科學)，2002，9(5):8-9.

8 Arvela P.Progress in pharmacology ToXicity of rare earths. Gustav Fischer tuttgart，1979.2(3):73-113.

9Yang XG(楊曉改)，Yang XD(楊曉達)，WANG K(王夔). Trends and problem in studies of rare-earths-based drugs. Progress In Chem(化學進展)，2007，19:201-204.

10 Wang Q，Wang YT，Pu SP，et al.Zinc coupling potentiates anti-HIV-1 activity of baicalin.Biochem Biophys Res Commun，2004，324:605-610.

11 Wu W(吳巍)，Zhou YH(周奕含)，Liu ZQ(劉志強)，et al.Studies on baicalin-Al(3+)complexes using electrospray tandem mass spectrometry.Chin J Anal Chem(分析化學研究簡報)，2005，33:683-686.

12 Deng Y(鄧毅).Study of chromium complexes with bacalein and MDG-1 polysacchairdes foranti-hyperglycemia.Shanghai:Shanghai Jiaotong University(上海交通大學)，PhD. 2007.

13 Jia CX(賈朝霞)，Wu Q(吳祺).Studise on complexes of copper(Ⅱ)-baicalin and their superoxide dismutase activity.J Inorg Chem(無機化學學報)，1990，6:106-108.

14 Ministry of health of the people's Republic of China，China National Standardization Management Committee.GBl5193. 3.The people's Republic of China National Standard Toxicity test(中華人民共和國國家標準急性毒性試驗).Beijing: Chemical Industry Press，2003，17-31.

15 Wang XJ(王學軍)，Liu X(劉雄)，Liu FL(劉峰林).Synthesis and characteristics of baicalin-rare earth complexes. Acta Chinese Medicine And Pharmacology(中醫(yī)藥學報)，2009，37(5):66-67.

Research on Synthesis and Biological Activities of Baicalin-La(Ⅲ)、Y(Ⅲ)Complexes

ZHANG Qi-xiong*，SHI Lun-yong，LIU Yan-ji
College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China

Baicalin-La(Ⅲ)、Y(Ⅲ)complexes was synthesized by a new method and characterized by IR、UV、LC-MS and metal elemental analysis.Their antimicrobial activity(Staphylococcus aureus，hay-bacillus，Escherichia coli，salmonella and Candida albicans)and antitumor activity(A549 and HepG2 cells)were tested and compared with baicalin through MTT.The result indicated that the structure of baicalin-La，baicalin-Y complex has changed greatly comparing with baicalin.The acute toxicity testing of mice showed that the compounds had no metal ion toxicity.The bioactivities about antimicrobial efficacy，antitumor efficacy were best for baicalin-La，secondary for baicalin-Y and worst for baicalin.

baicalin;rare-earth metal;complexes;antibacterial;antitumor

1001-6880(2012)10-1398-04

2012-03-14 接受日期:2012-06-21

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201210635074)

*通訊作者 E-mail:zhangqixiong@vip.qq.com

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