兔精液常溫保存稀釋液篩選及人工授精效果的試驗

張海容

（1.德州學(xué)院農(nóng)學(xué)系，山東 德州253023；2.德州兔業(yè)工程技術(shù)中心，山東 德州253023）

隨著兔的人工授精技術(shù)在集約化養(yǎng)兔場中的推廣與應(yīng)用，精液保存技術(shù)越來越受到重視，并日益顯示出在降低養(yǎng)殖中的飼養(yǎng)成本發(fā)揮作用。雖然冷凍精液不受地域和時間的限制，家兔的精液冷凍保存研究早于其他家畜，但進展緩慢，在生產(chǎn)實踐中沒有得到廣泛的應(yīng)用［1－2］。從液態(tài)精液保存效果來看 ，常溫保存更有利于兔的實際生產(chǎn)應(yīng)用中［3］。為此，近年來精液常溫保存方法已廣泛應(yīng)用于兔的人工授精技術(shù)中。目前，市場上主要從國外引入的稀釋液和常用的0.9%生理鹽水、5%葡萄糖和葡－檸－卵，國外進口稀釋液價格較貴，對規(guī)?；脠鲳B(yǎng)殖，0.9%生理鹽水、5%葡萄糖效果不佳，而葡－檸－卵稀釋液要先用現(xiàn)配，使用不方便，針對以上情況。研究開發(fā)國內(nèi)優(yōu)良稀釋液，對增加養(yǎng)兔效益，推動兔規(guī)模化養(yǎng)殖和人工授精技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。本試驗為研制優(yōu)良稀釋液而進行有益的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點 2009年4月20日～2009年11月22日。山東省德州肉兔場。

1.2 試驗藥品和試驗儀器 葡萄糖（分析純）、Tris、檸檬酸、檸檬酸鈉（分析純）、氯化鉀、碳酸氫鈉、EDTA（分析純）、青霉素、鏈霉素、德國進口稀釋粉。

試驗儀器：密度儀，電子顯微鏡，恒溫水浴鍋，雙蒸餾水器，磁力攪拌器，恒溫板，精密溫度計。

1.3 精液樣品采集 供試驗用精液隨機采自肉兔場健康公兔，采用采精器采集5只公兔精液混合后備用，鏡檢活率在0.8以上者供稀釋保存使用。

1.4 稀釋液配方 0.9%生理鹽水、5%葡萄糖、葡－檸－卵稀釋配方、自配葡－檸－EDTA、Tris－葡－檸配方和德國進口稀釋液（見表1）。

表1 稀釋液配方

1.5 稀釋液保存效果觀察

1.5.1 稀釋液的配制 按配方要求準確稱量稀釋液各成分，并放入消毒過的干燥燒杯內(nèi)，用雙蒸水稀釋至100mL，用玻璃棒攪拌使其充分溶解。溶解后每100mL稀釋液加入青霉素、鏈霉素各10萬IU（μg），稀釋液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.2 精液的稀釋及保存 精子活力在0.8以上，密度在7×108以上。對所采的精液分別用5種稀釋液按1∶6～1∶10倍等溫稀釋，稀釋精液時，將稀釋液沿杯壁慢慢倒入精液中，然后將分裝好的精液轉(zhuǎn)存于15℃恒溫箱內(nèi)保存。

1.5.3 稀釋液保存效果觀察及指標測定 按10級評分法評定精子的活力，每6h觀察評定1次，直至精子全部死亡，根據(jù)活力變化情況，計算有效存活時間（精子活力在0.5以上的保存時間）、總存活時間（精子全部失活的保存時間）、生存指數(shù)（∑［﹙上次活力＋下次活力﹚／﹙2×?xí)r間間隔﹚］。

1.6 配種試驗 經(jīng)產(chǎn)母兔采用孕馬血清激素和超排3號同期誘導(dǎo)發(fā)情，稀釋液稀釋精液1～2d的保存后，對發(fā)情母兔進行輸精，采用摸胎方式確定受胎率。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的t檢驗及方差分析進行數(shù)據(jù)處理。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 精子有效存活時間和總存活時間 見表2。

表2 不同精液稀釋液有效存活時間和總存活時間試驗結(jié)果（h）

從表2可以得知，保存于 Tris－葡－檸、葡－檸－EDTA和德國進口稀釋粉的精子的有效存活時間差異不顯著（P＞0.05），較葡－檸－卵分別延長29.2 h、35.6h、32.6h，差異極顯著（P＜0.01），較5%葡萄糖和0.9%生理鹽水延長48.8h、55.2h、52.2h和50.3h、56.7h、53.7h，差異極顯著（P＜0.01）。而精子總存活時間與精子有效存活時間有相似趨勢。結(jié)果表明，從精子總存活時間與精子有效存活時間來看，Tris－葡－檸、葡－檸－EDTA和德國進口稀釋液保存效果最好。

2.2 精子生存指數(shù) 由表3可知，Tris－葡－檸、葡－檸－EDTA和德國進口稀釋液保存精子的生存指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），都極顯著高于其他3種常用稀釋液（P＜0.01）。

表3 不同精液稀釋液保存精子的生存指數(shù)試驗結(jié)果

2.3 稀釋液保存精液輸精后受胎率統(tǒng)計 不同稀釋液保存精液輸精后受胎率統(tǒng)計結(jié)果見表4。精子的保存時間過長，會導(dǎo)致精子畸形率上升，受胎率下降，葡－檸－EDTA、Tris－葡－檸和德國進口稀釋液稀釋液保存1d和2d內(nèi)，受胎率都是最高的，而0.9%生理鹽水和5%葡萄糖保存是受胎率最低。在兔場規(guī)模化養(yǎng)殖過程中，保存于稀釋液中1～2d的精液足以滿足人工授精的需求。

表4 釋液保存精液輸精后受胎率及產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計

3 討論

對精子有效存活時間、總存活時間、生存指數(shù)和受胎率的測定結(jié)果表明，葡－檸－EDTA、Tris－葡－檸和德國進口稀釋液保存效果一致，保存精子的效果優(yōu)于0.9%生理鹽水、5%葡萄糖和葡－檸－卵。從價格成本上計算，德國進口稀釋液＞Tris－葡－檸＞葡－檸－EDTA，而且兔場輸精所用的精液保存2d以內(nèi)的精液，葡－檸－EDTA精液稀釋粉配好后，可在4℃～10℃溫度下保存半年，使用方便。因此對規(guī)模養(yǎng)兔場來說，可在生產(chǎn)中推廣使用，效果良好。

［1］袁慕陶，尹召華.兔精液的液態(tài)保存對受胎率的影響［J］.毛皮動物飼養(yǎng)，1989，1：5－7.

［2］Viudes－de－Castro M P，Vicente J S.A simple method for freezing rabbit semen with successful results on fertility and prolificity［J］.Animal Reproduction Science，1996，44：195－201.

［3］張嘉保，周虛.動物繁殖學(xué)［M］.長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1999.