山西育成小麥品種Wxay蛋白缺失體的篩選與鑒定

王曙光 孫黛珍 王慧慧 曹亞萍 賈壽山 史雨剛 彭鎖堂

山西育成小麥品種Wxay蛋白缺失體的篩選與鑒定

王曙光1孫黛珍1王慧慧1曹亞萍2賈壽山1史雨剛1彭鎖堂1

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院1，太谷 030801)
(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所2，臨汾 041000)

Wx蛋白即顆粒結(jié)合型淀粉合酶，由Wx－A1、Wx－B1和Wx－D1三個亞基組成，其中任意一個亞基的缺失都影響著小麥籽粒中直鏈淀粉的含量，為了解山西育成小麥品種Wx蛋白缺失類型，用SDSPAGE和分子標(biāo)記技術(shù)分別在蛋白質(zhì)和DNA水平上對175份山西育成的小麥品種資源進行了分析，共檢測到1份Wx－A1亞基缺失材料臨優(yōu)2018，6份Wx－B1亞基缺失材料——臨汾98－1017、晉麥54、晉農(nóng)76、長6154、太麥703和太麥8003，沒有發(fā)現(xiàn)缺失Wx－D1亞基、同時缺失兩個亞基和三個亞基全缺失的材料。

小麥 Wxay蛋白 SDS－PAGE 分子標(biāo)記

在普通小麥直鏈淀粉合成過程中起主要作用的顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSSⅠ)也稱Waxy蛋白［1］。Waxy蛋白由Wx－A1、Wx－B1和Wx－D1三個亞基組成，其編碼基因分別位于7AS、4AL和7DS上［2－3］。Waxy蛋白亞基缺失會使胚乳中直鏈淀粉合成減少，支鏈淀粉含量上升，當(dāng)三個亞基全部缺失時，小麥籽粒胚乳中直鏈淀粉含量接近于0或很少(＜1%)，這種小麥稱為糯小麥［3］。普通小麥的Waxy亞基組成理論上分為8種類型，自然界中存在5種:正常、缺失Wx－A1、缺失Wx－B1、缺失Wx－D1、缺失Wx－A1和Wx－B1［4］。除野生型外，Wx－B1缺失型最常見。不同Waxy蛋白缺失類型的小麥品種，其小麥粉的直鏈淀粉含量不同，在一定程度上影響面條、面包等以小麥粉為原料的食品品質(zhì)，以缺失Wx－B1亞基對直鏈淀粉含量的影響最明顯［5－6］。因此研究小麥Waxy蛋白的遺傳變異對于選育適合不同加工目的的小麥品種具有重要意義。

山西省南北狹長，橫跨暖溫帶和中溫帶兩個氣候帶，在全國生態(tài)區(qū)劃中，又分別屬于黃淮冬麥區(qū)、北方冬麥區(qū)和北方春麥區(qū)，加之海拔高度差異大，地形復(fù)雜，形成各地差異懸殊的自然條件和復(fù)雜多樣的氣候生態(tài)類型，各地小麥品質(zhì)存在明顯差異，形成不同的品質(zhì)生態(tài)類型，因此有必要對其Waxy蛋白的組成進行分析鑒定。本研究以175份山西育成的小麥品種(系)為材料，利用SDS－PAGE和分子標(biāo)記技術(shù)篩選鑒定其Waxy蛋白的缺失體，以期為今后小麥品質(zhì)育種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

選用175份山西育成的小麥品種(系)，其中中部晚熟冬麥區(qū)73份，南部中熟冬麥區(qū)102份(表1)，以中國春(CS)為對照。所有供試材料于2009年10月種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗田，每個品種2行，行長2 m，行距25 cm。田間管理同大田，灌漿期注意去雜，2010年6月收獲。

1．2 試驗方法

1．2．1 Waxy蛋白的提取和SDS－PAGE電泳

Waxy蛋白的提取參照王子寧等［7］的方法，SDS－PAGE電泳參考Zhao等［8］和王子寧等［7］的方法。

1．2．2 Waxy基因位點的檢測

總DNA的提取采用Devos等［9］改進的酚－氯仿法。

引物1用于檢測Wx－7A和Wx－7D的SSR標(biāo)記，由Shariflou［10］開發(fā)，目標(biāo)擴增片段是包括3'末端附近(AT)n重復(fù)序列在內(nèi)的265和204 bp的序列。

上游引物:5'—CGCTCCCTGAAGAGAGAAAGAA—3'

下游引物:5'—ATAGGCACAACCCCTAAC—3'

PCR擴增體系為20μL，擴增反應(yīng)在Eppendorf Thermocycler上進行，反應(yīng)條件為:首先95℃變性3 min;然后94℃變性1 min，58℃退火50 s，72℃延伸50 s，38個循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。

引物2用于檢測Wx－4A基因位點的STS引物，由Briney［11］開發(fā)，目標(biāo)擴增片段包括第4內(nèi)含子在內(nèi)的一段440 bp序列。

上游引物:5'—AACCAGCAGCGCTTCAGCCT—3'

下游引物:5'—TTGAGCTGCGCGAAGTCGTC—3'

PCR擴增體系為20μL，擴增反應(yīng)在Eppendorf Thermocycler上進行，反應(yīng)條件為:首先94℃變性3 min;然后94℃變性15 s，64℃退火2 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物中加10μL的變性緩沖液，95℃變性5 min。擴增產(chǎn)物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2．1 山西育成小麥品種Waxy蛋白的SDS－PAGE鑒定

對175份山西育成小麥品種Waxy蛋白進行SDS－PAGE檢測，共有7份Wx蛋白亞基缺失的材料，包括1份Wx－A1缺失的材料和6份Wx－B1缺失的材料(表1)。Wx－A1缺失的是臨優(yōu)2018(圖1)，Wx－B1缺失的是晉麥54、臨汾98－1017、長6154、晉農(nóng)76、太麥703和太麥8003。沒有發(fā)現(xiàn)Wx－D1缺失、兩個亞基同時缺失和三個亞基全缺失的品種(即全糯性品種)。

表1 175份小麥品種Wxay 蛋白篩選鑒定結(jié)果

續(xù)表

續(xù)表

圖1 山西小麥品種Waxy蛋白的SDS－PAGE電泳圖

2．2 Wx－A1和Wx－D1亞基的SSR分子標(biāo)記鑒定

小麥Wx基因cDNA序列的近3'端有不完整的(AT)6A(AG)2，大麥Waxy基因在相似位點也有類似的(AT)4重復(fù)序列，Sharriflou等［10］據(jù)此設(shè)計了一對引物，用這一引物進行PCR擴增，結(jié)果得到兩條帶，一條是204 bp的特異條帶，另一條約265 bp，中國春N7A－T7D(Wx－A1亞基缺失)缺失了265 bp的特異條帶，N7D－T7A(Wx－D1亞基缺失)缺失了204 bp的特異帶。所以這一引物可以作為Wx－A1和Wx－D1亞基的特異分子標(biāo)記。

用這一標(biāo)記鑒定175份山西小麥品種資源的Waxy蛋白的Wx－A1和Wx－D1亞基是否缺失，發(fā)現(xiàn)圖2中第18泳道的臨優(yōu)2018缺失265 bp的目標(biāo)條帶，證明其缺失Wx－A1亞基，其余品種都擴增到兩條目標(biāo)帶，證明Wx－A1和Wx－D1沒有缺失，與SDS－PAGE結(jié)果一樣。

2．3 Wx－B1亞基的STS分子標(biāo)記鑒定

Briney等［11］設(shè)計的STS－PCR引物序列，從野生型普通小麥的Wx－B1位點可擴增出440 bp左右的產(chǎn)物，而在突變型中由于基因的大片段缺失則無此產(chǎn)物，所以這一標(biāo)記可以用來鑒定Wx－B1亞基是否缺失。用這一標(biāo)記檢測175份供試材料，發(fā)現(xiàn)晉麥54、臨汾98－1017、晉農(nóng)76、長6154、太麥703和太麥8003未擴增出440 bp的目標(biāo)帶，表明缺失Wx－B1亞基(圖3)，而其余品種都擴增出440 bp的目標(biāo)帶，印證了SDS－PAGE檢測結(jié)果。

圖3 部分品種Wx－7B基因的分子標(biāo)記檢測

圖2 部分品種Wx－7A、Wx－7D基因的分子標(biāo)記檢測

2．4 山西育成小麥品種Waxy蛋白缺失體的分布

SDS－PAGE與分子標(biāo)記鑒定表明所有供試材料以Wx－B1缺失型居多，共6份，占材料總數(shù)的3．4%;其中中部晚熟冬麥區(qū)有4份，占其總數(shù)的4．1%;南部中熟冬麥區(qū)2份，占其總數(shù)的1．9%。缺失Wx－A1的材料1份，占材料總數(shù)的0．59%，占南部中熟冬麥區(qū)的0．98%(表2)。

表2 供試品種Waxy蛋白亞基分析

3 討論

Waxy蛋白是小麥直鏈淀粉合成過程中的一種關(guān)鍵酶，與小麥粉品質(zhì)關(guān)系密切。研究小麥Waxy蛋白的亞基組成，篩選突變體，為培育適合不同加工品質(zhì)的小麥品種提供親本材料，對改善小麥品質(zhì)具有重要意義。Yamamori等［2］研究了日本等11個國家的1960份小麥材料，發(fā)現(xiàn)朝鮮、日本和土耳其的小麥中主要是Wx－A1亞基缺失型，澳大利亞和印度的小麥品種主要是Wx－B1亞基缺失型。中國的小麥品種中Waxy蛋白亞基突變的比例不高，主要的突變體是Wx－B1缺失型，且發(fā)現(xiàn)了世界上僅有的Wx－D1缺失型小麥品種白火麥［12］。王海萍［13］對山西省、河南省、河北省等九個省市的冬播小麥品種進行分析，結(jié)果證明各省市小麥品種Waxy蛋白亞基缺失頻率差異較大，山西省缺失頻率為3．72%。徐兆華等［14］對國內(nèi)冬播麥區(qū)294份小麥品種(系)篩選結(jié)果表明各個麥區(qū)之間Waxy蛋白亞基缺失頻率差異較大，北部冬麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)和長江中下游春麥區(qū)的頻率較低，西南冬麥區(qū)的頻率較高。本試驗檢測了175份山西冬小麥材料，Wx－B1缺失頻率較高，與前人研究結(jié)果相似［12－13］。

分子標(biāo)記在研究遺傳多樣性和理解各種性狀的遺傳控制方面具有重要作用，其在作物育種和選擇工作的輔助作用越來越受重視，世界各國都在積極篩選簡便、實用和可靠的分子標(biāo)記，同時十分注重對已有標(biāo)記的驗證。基于小麥Waxy基因的cDNA序列，目前已有多個Waxy蛋白的分子標(biāo)記［12，15－16］。本試驗選用的兩個分子標(biāo)記分別是由Shariflou等［10］開發(fā)的一個Wx－A1和Wx－D1基因的SSR標(biāo)記以及Briney等［11］開發(fā)的一個Wx－B1基因STS標(biāo)記，王海萍［14］用中國春的相應(yīng)缺體四體對這兩個標(biāo)記進行檢驗，證實其輔助選擇Waxy蛋白缺失體的有效性。本研究在SDS－PAGE鑒定的基礎(chǔ)上，利用這兩對引物對所有供試材料進行了鑒定篩選，提高了試驗結(jié)果的可靠性。

4 結(jié)論

4．1 用SDS－PAGE和分子標(biāo)記檢測到1份Wx－A1亞基缺失材料臨優(yōu)2018，6份Wx－B1亞基缺失材料——臨汾98－1017、晉麥54、晉農(nóng)76、長6154、太麥703和太麥8003，沒有發(fā)現(xiàn)缺失Wx－D1亞基、同時缺失兩個亞基和三個亞基全缺失的材料。

4．2 用Wx－A1和Wx－D1基因的SSR標(biāo)記進行擴增后，正常材料得到204 bp和265 bp兩條帶，蛋白檢測存在Wx－A1和Wx－D1亞基;蛋白檢測缺失Wx－A1亞基的材料只擴增出204 bp的條帶，缺失265 bp的條帶。用Wx－B1基因的STS標(biāo)記進行擴增，缺失440 bp條帶的材料，蛋白檢測缺失Wx－B1亞基。證明這兩個標(biāo)記可以用于Wxay基因的輔助選擇。

志謝:山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系小麥產(chǎn)業(yè)專項資助。

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Screening and Identification of Wxay Protein Mutants of Wheat Varieties Bred in Shanxi

Wang Shuguang1Sun Daizhen1Wang Huihui1Cao Yaping2Jia Shoushan1Shi Yugang1Peng Suotang1
(College of Agriculture，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801)
(Wheat Research Institute，Shanxi Academy of Agriculture Sciences2，Linfen 041000)

Wx protein，granule－bound starch synthase，is composed of Wx－A1、Wx－B1 and Wx－D1subunits，deficiency of which will make starch content of wheat grains decrease．In order to discover more Wxay protein deficiency mutants，175 wheat varieties bred in Shanxi were identified at the nucleotide and protein levels using SDS－PAGE and molecular markers．The result indicated that 1 variety，Linyou2018 were the null of Wx－A1 types，6，Linfen98－1017，Jinmai54，Jinnong76，Chang6154，Taimai703，Taimai8003 were the null of Wx－B1 types，the null of Wx－D1 and the null of any 2 or 3 subunits were not detected．

wheat，waxy protein，SDS－PAGE，molecular marker

S512．1;S336

A

1003－0174(2012)07－0006－06

山西省科技攻關(guān)項目(2007031001－6、20100312001)，山西省回國留學(xué)人員擇優(yōu)資助項目(2008)，山西省留學(xué)基金(2010048)

2011－08－08

王曙光，男，1962年出生，碩士，小麥遺傳育種

孫黛珍，女，1964年出生，博士，教授，小麥遺傳育種